Bindungsaffinität

Die Bindungsaffinität ist die Stärke der bindenden Wechselwirkung zwischen einem einzelnen Biomolekül (z. B. Protein oder DNA) und seinem Liganden/Bindungspartner (z. B. Arzneimittel oder Inhibitor). Die Bindungsaffinität wird üblicherweise mit der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K_D) gemessen und angegeben, die zur Beurteilung und Klassifizierung der Stärke bimolekularer Wechselwirkungen herangezogen wird. Je kleiner der K_D-Wert ist, desto größer ist die Bindungsaffinität des Liganden an sein Ziel. Je größer der K_D-Wert ist, desto schwächer werden Zielmolekül und Ligand angezogen und binden sich aneinander. 

Die Bindungsaffinität wird durch nichtkovalente intermolekulare Wechselwirkungen, wie z. B. Wasserstoffbrückenbindungen, elektrostatische Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte zwischen den beiden Molekülen, beeinflusst. Darüber hinaus kann die Bindungsaffinität zwischen einem Liganden und seinem Zielmolekül durch das Vorhandensein anderer Moleküle beeinflusst werden.

Wann immer Sie Proteine, Nukleinsäuren und Biomoleküle charakterisieren, ist das Verständnis der Bindungsaffinität zu Substraten, Inhibitoren und Cofaktoren der Schlüssel zur Schätzung derintermolekularen Wechselwirkungen, die zum Beispiel bei der Untersuchung enzymatischer Reaktionen, Proteinkomplexe oder Rezeptorbindung relevant sind. In der Arzneimittelforschung hilft Bindungsaffinität, Medikamente zu entwickeln, die ihre Ziele selektiv und spezifisch binden.

Es gibt viele Methoden, die Bindung zu messen. Qualitative Methoden (z. B. Bindung: ja/Nein) wie ELISA, Gel-Shift-Assays und quantitative Methoden (z. B. Bindungsaffinität) wie spektroskopische Assays, optische Biosensoren (z. B. GCI) und isotherme Titrationskalorimetrie.

Es gibt viele Möglichkeiten, die Bindungsaffinität zu messen, einschließlich Methoden, die eine Markierung der Interaktoren erfordern, und markierungsfreie Ansätze. Die wichtigste gekennzeichnete qualitative Methode (d. h. Bindung: Ja/Nein) ist der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Zu den wichtigsten markierungsfreien, quantitativen Methoden gehören spektroskopische Assays, isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) oder optische Biosensoren wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), Bioschichtinterferometrie (BLI) und gittergekoppelte Interferometrie (GCI).

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

ELISA ist eine plattenbasierte Assay-Technik, die einen immobilisierten Liganden verwendet, um einen Zielanalyten aus einer Lösung einzufangen, und spezielle Nachweisreagenzien (die Markierungen) verwendet, um die Reaktion zwischen den beiden Molekülen zu analysieren.

Oberflächenplasmonresonanz (SPR)

SPR ist eine markierungsfreie optische Sensortechnik, die molekulare Wechselwirkungen als Änderungen des Brechungsindex innerhalb eines lokalisierten evaneszenten Feldes des Oberflächenplasmons erkennt. Mikrofluidische Kanäle ermöglichen genauere Messungen.

Biolayer-Interferometrie (BLI)

BLI verwendet einen optischen Biosensor, um Änderungen im Interferenzmuster des von der Biosensorspitze reflektierten Lichts zu messen. Die Spitze des Biosensors ist typischerweise mit einem Fängermolekül beschichtet und wird in eine Probenlösung getaucht, die den interessierenden Analyten enthält. BLI ist kennzeichnungsfrei.

Gittergekoppelte Interferometrie (GCI)

GCI ist eine markierungsfreie optische Sensortechnik, bei der ein Proben- und Referenzstrahl in einen faseroptischen Wellenleiter eingekoppelt wird. Die Bindungsaffinität und -kinetik werden durch Messung der zeitabhängigen Phasenverschiebungssignale analysiert, die aus der Wechselwirkung resultieren.

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)

ITC misst die mit der Bindungswechselwirkung verbundene Wärmeänderung und bestimmt die Bindungsstöchiometrie und Thermodynamik.

Wie auch immer Sie die Bindungsaffinität messen, die Messung führt zu mehreren Berichtspunkten, aus denen eine Bindungsaffinitätskurve erstellt werden kann. Diese Kurve hängt sowohl von der Konzentration der Probe als auch von der Wechselwirkung zwischen Probe und Ziel ab.

Daher ist es wichtig, zusätzlich zu Ihren regelmäßigen, ordnungsgemäßen experimentellen Kontrollen die Konzentration Ihrer Probe zu kennen und die richtige Inkubationszeit zu berücksichtigen. Es ist besonders wichtig, während Ihres Tests ein Gleichgewicht zu erreichen (wobei die Menge der an das Ziel bindenden Moleküle der Menge entspricht, die sich vom Ziel löst). Ohne Erreichen des Gleichgewichts kann die Affinität nicht zuverlässig bestimmt werden, da das Bindungsmodell nicht zuverlässig angepasst werden kann.

Erfahren Sie mehr in unserem Kinetik-Leitfaden.

Malvern Panalytical bietet sowohl Gitter-gekoppelte Interferometrie (GCI) als auch isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) an. Beide Techniken sind markierungsfrei und ermöglichen die Verwendung nativer Moleküle. Aus beiden kann eine hochgradig quantitative Affinität (K_D-Werte) für eine Vielzahl von Wechselwirkungen abgeleitet werden.

Die GCI ist eine optische Methode, die die Veränderung des Brechungsindexes in einem durch das Bindungsereignis hervorgerufenen abklingenden Feld misst und zur Untersuchung der Affinität und Kinetik einer Wechselwirkung verwendet wird. Die GCI misst K_D-Werte im millimolaren bis pikomolaren Bereich und bestimmt zusätzlich die Kinetik einer Wechselwirkung, genauer gesagt die An- (k_a) und Aus-Raten (k_d).

Die ITC misst die mit dem Bindungsereignis verbundene Wärmemengenänderung. Die ITC misst K_D-Werte im millimolaren bis nanomolaren Bereich, und bestimmt auch die Bindungsstöchiometrie und Bindungsthermodynamik der Wechselwirkung. Sowohl die Kinetik als auch die Thermodynamik sind bei der Charakterisierung intermolekularer Wechselwirkungen wichtig. 

Die Affinität beider Geräte ist orthogonal und kann zusammen Vertrauen schaffen, wenn ein hochgradig quantitativer K_D-Wert erforderlich ist, beispielsweise in Anwendungen zur Leitsubstanzoptimierung usw. 

Die GCI profitiert von einer höheren Empfindlichkeit, einem höheren Durchsatz und einem geringeren Probenverbrauch und bietet eine gute Leistung bei Rohproben. Wenn diese Faktoren und die kinetischen Informationen für Ihre Anwendung am wichtigsten sind, dann ist dies eindeutig das geeignete Instrument für Sie. 

Wenn die thermodynamischen Daten (Enthalpie und Entropie) und die Stöchiometrie am wichtigsten sind, dann ist ITC die beste Lösung. Die ITC profitiert auch von der minimalen Assay-Entwicklung und kann daher schneller zu einem Ergebnis führen, wenn nur eine kleine Anzahl von Messungen eines bestimmten Paares von Wechselwirkungen erwartet wird. Die Technik ist zudem zerstörungsfrei und die Probe kann nach dem Experiment wiederverwendet werden. 

WAVEsystem  (GCI) und MicroCal PEAQ-ITC wurden beide mit Blick auf den Nutzer entwickelt und sind für eine einfache Bedienung in ihren jeweiligen Geräteklassen bekannt.