Bindungskinetik

Biomolekulare Bindungsprüfungen können mit markierten Molekülen (radioaktive Marker, Fluoreszenzmarker usw.) durchgeführt werden, es sind jedoch geeignete, unterbrechungsfreie Markierungen und häufig aufwendige Wasch- und Reinigungsschritte erforderlich. 

In markerfreien Quantifizierungsstudien wird eines der zu analysierenden Moleküle auf eine Oberfläche (den Liganden) immobilisiert, und die anderen Moleküle bleiben in freier Lösung (dem Analyten). 

Das Sensorogramm (grafische Darstellung der Echtzeitmessung) zeigt eine typische Studie zur Bindung von Analyt-Ligand in Echtzeit.

Bild rechts: Typisches Sensorogramm, das die Phasen-Grundlinie, die Assoziation, die Dissoziation und die Rückkehr zur Grundlinie zeigt.

Zunächst wird, wie im Sensorogramm gezeigt, eine Grundlinie bestimmt. Einfach ausgedrückt, ist dies der Brechungsindex nur des Liganden. Anschließend wird der ungebundene Analyt in der Lösung hinzugefügt und die Assoziation (Bindung) als Änderung dieses Brechungsindex gemessen. Nach der Assoziationsphase wird die Lösung mit dem ungebundenen Analyten entfernt und die Dissoziation gemessen. Obwohl der Signalpegel in einem Sensorogramm mit dem beteiligten Liganden und Analyten und der Stärke ihrer Interaktion korreliert, befinden sich die wertvollen Informationen in der Krümmung ihrer Assoziations- und Dissoziationsphasen. Zum Beispiel die gewünschte biologische Wirkung eines Medikaments, die mit seiner Verweilzeit (Dissoziationsphase) und nicht nur seiner Affinität verbunden ist.

Messungen mit einer einzigen Analyteinspritzung bei einer einzigen Konzentration (einzyklische Kinetik) sind schnell, liefern jedoch keine zuverlässigen Schätzungen aller kinetischen Parameter. Traditionell wird die Kinetik in einem multizyklischen kinetischen Experiment gemessen: Eine zuverlässige und detaillierte kinetische Analyse erfordert Daten von mindestens vier bis sechs Analytkonzentrationen, die den Bereich des 0,1- bis 10-fachen der erwarteten K_D abdecken. Dies erfordert Verdünnungsreihen und Dissoziationsschritte zwischen den Zyklen. Daher ist die mehrzyklische Kinetik zeitintensiv und nicht für das Screening Tausender von Kandidatenverbindungen geeignet. 

Die regenerationsfreie Kinetik ermöglicht eine schnellere Analyse, indem die Regenerationsschritte übersprungen werden. Die regenerationsfreie kinetische Analyse kann jedoch nur dann angewendet werden, wenn sich der Analyt langsam dissoziiert, da sie auf diesen geringen Analyt-Dissoziaten während der Zyklen steigender Analytkonzentration basiert. Wir haben eine revolutionäre Nachweismethode entwickelt: Repeated Analyte Pulses of Increasing Duration – waveRAPID reduziert die Assayzeit und den Reagenzienverbrauch drastisch und verbessert gleichzeitig die Messwerte, um Leads in der Arzneimittelforschung schneller und zuverlässiger zu identifizieren. 

WaveRAPID verwendet Analytimpulse in einer einzigen Konzentration, aber jeder Impuls wird für eine erhöhte Dauer angewendet. Erfahren Sie, wie Sie mit unseren Methoden schneller und einfacher auf kinetische Daten zugreifen können: die neu entwickelte waveRAPID-Methode und die Direct Kinetics-Software, die ein 1-Klick-Auswertungstool bietet.

Mit der Einführung des WAVEsystems bietet Malvern Panalytical nun auch einen optischen Biosensor zur Untersuchung der Echtzeit-Bindungskinetik an. 

Das WAVEsystem kann genutzt werden, um Antworten auf eine Vielzahl wissenschaftlicher Fragen zu geben. Dazu gehören die Bestimmung, ob zwei Moleküle interagieren und welche Bindungsaffinität die Moleküle haben (K_D), sowie die Bestätigung der biologisch aktiven Konzentration eines bestimmten Analyten in einer Probe. 

Darüber hinaus kann das WAVEsystem die kinetischen Reaktionsparameter wie die Assoziationsratenkonstante (k_a) und die Dissoziationsratenkonstante (k_d) messen, indem es die Bindung von Analyt-Ligand in Echtzeit beobachtet. 

Besuchen Sie unsere Seite zum GCI-Verfahren, um zu erfahren, warum das WAVEsystem mit seinem proprietären GCI-Verfahren eine bessere Auflösung als die herkömmliche Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und Bio-Layer-Interferometrie (BLI) bietet.