Schnelle Charakterisierung der Bindung an ungereinigte GPCRs

Zusammenfassung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind aufgrund ihrer wesentlichen Rolle bei der Regulierung physiologischer Prozesse wichtige therapeutische Ziele. GPCRs, auf die über 30 % der zugelassenen Arzneimittel abzielen, sind bekanntermaßen schwierig zu untersuchen, da sie aufgrund ihrer Hydrophobie nach der Extraktion aus der Zellmembran extrem instabil sind.

Dank der patentierten verstopfungsfreien Mikrofluidik ermöglicht das Creoptix WAVE Forschern die Untersuchung von GPCRs sowohl in Lösung (mit Reinigungsmittel gelöst oder in einer Lipidumgebung wie Nanodiscs rekonstituiert) als auch in Membranen, wo sie ihre native Konformation beibehalten können. Durch den Einsatz der proprietären Gitter-gekoppelten Interferometrie (GCI)-Technologie, die eine außergewöhnliche Empfindlichkeit bietet, kann das Creoptix WAVE ein breites Spektrum von Affinitäten und Off-Raten analysieren und so das Verständnis von G-Protein/GPCR-Wechselwirkungen verbessern.

Durch die Charakterisierung der Bindungskinetik und Affinität des G-Proteins mini-G_o1 an ein Rohpräparat des ungereinigten, mit n-Dodecyl β-D-Maltosid (DDM)-gelösten Serotonin 5-HT_1B-Rezeptors (5-HT_1BR) und durch die Kombination der Proben-Puffer-Injektion mit einem schnellen und „schmutzigen“ Reinigungsprozess zeigen wir, dass das Creoptix WAVE wesentliche Erkenntnisse zur GPCR-Signalübertragung und -Pharmakologie liefert.

Materialien und Methoden

Trichoplusia ni -Insektenzellmembranen, die das His-markierte 5-HT _1B R, den Agonisten Donitriptan und das gentechnisch veränderte mini-G _o1 exprimieren, wurden freundlicherweise von Dr. Chris Tate (MRC Laboratory of Molecular Biology - Cambridge, UK) bereitgestellt.

Zellmembranen aus etwa 30 ml Kultur wurden 30 Minuten lang mit 0,5 % DDM gelöst, und das rohe Solubilisat wurde nach einer 30-minütigen Zentrifugation mit 20.000 x g im Überstand zurückgewonnen. Das vorgeschlagene schnelle und "schmutzige" Verfahren nimmt weniger als eine Stunde in Anspruch und eignet sich für stabile GPCRs mit Expressionswerten von mindestens 0,5 mg/l Zellkultur. Details zum schnellen und „schmutzigen“ Reinigungsprozess sind in Abbildung 1 dargestellt.

Anschließend wurde das His-markierte, DDM-gelöste 5-HT_1BR auf einem Ni²⁺-NTA-Chip (WAVEchip 4PCH-NTA) erfasst und mit Amin gekoppelt. Das His-markierte mini-G_o1 - die Negativkontrolle - wurde auf dem Referenzkanal des WAVEchips erfasst und mit Amin gekoppelt. Die Bindung von G-Protein an den gelösten GPCR wurde mit dem Proben-Puffer-Injektionsprozess überwacht (Abbildung 2), bei dem vor der Bindung von mini-G_o1 5-HT_1BR durch die Injektion des Agonisten Donitriptan aktiviert wird.

Abbildung 1: Standardprozess im Gegensatz zum schnellen und „schmutzigen“ GPCR-Reinigungsprozess

Abbildung 2: Proben-Puffer-Injektionsprozess

Ergebnisse

Die Dosiswirkungskurven wurden für 7 Konzentrationen von mini-G_o1 im Bereich von 1 nM bis 16,8 μM im Probenpuffer aufgezeichnet. Die Durchflussrate betrug 30 μl/min, die Messungen wurden bei 10 °C durchgeführt.

Abbildung 3 zeigt die Bindungskurven, die für die mini-G_o1-Bindung an DDM-gelöste, Donitriptan-gebundene 5-HT_1BR aufgezeichnet wurden. Die Daten wurden doppelt referenziert und mit einem heterogenen Ligandenmodell angepasst (unter Berücksichtigung von zwei Ligandenarten). Die kinetischen Parameter sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt. Die K_D-Werte stimmen gut mit den zuvor berichteten Daten des Fluoreszenzsättigungsbindungsassays (FSBA) überein.¹

Abbildung 3: mini-G_o1-Kinetik

Wichtige Erkenntnisse

Mit dem Creoptix WAVE können Sie die Signalübertragung und Pharmakologie von GPCRs besser verstehen und den Wirkstoffentwicklungsprozess im Frühstadium beschleunigen:

• Weniger Material verwenden: sicheres Arbeiten mit ungereinigten Solubilisaten
• Zeit sparen: Arbeiten mit suboptimalen Assay-Bedingungen
• Verabschieden Sie sich von langwierigen und mühsamen Rezeptorreinigungsverfahren: Lassen Sie sich nicht von Verunreinigungen abschrecken, und arbeiten Sie mit Rohproben mit verstopfungsfreier, robuster Mikrofluidik.

Ideal für:

• Screening verschiedener G-Proteine, die an denselben Rezeptor binden
• Screening der G-Protein-Bindung in verschiedenen Reinigungsmitteln
• Arzneimittelcharakterisierung (inverser Agonist, Agonist) mit G-Protein-Bindung als Ergebnis

Literatur:

1. Nehmé R, Carpenter B, Singhal A, Strege A, Edwards PC, White CF, et al. (2017) Mini-G proteins: Novel tools for studying GPCRs in their active conformation. (Mini-G-Proteine: Neuartige Werkzeuge zur Untersuchung von GPCRs in ihrer aktiven Konformation). PLoS 12(4): e0175642.: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0175642