Cinética de ligação

Os ensaios de ligação biomolecular podem ser realizados com o uso de moléculas marcadas (radiomarcadores, marcadores fluorescentes etc.), mas é necessária uma marcação adequada sem interrupções e, muitas vezes, etapas elaboradas de lavagem e purificação. 

Em estudos de quantificação sem marcadores, uma das moléculas a serem analisadas é imobilizada em uma superfície (o ligante), e as outras moléculas ficam livres na solução (o analito). 

O sensorgrama (uma representação gráfica da medição em tempo real) mostra um estudo típico de ligação analito-ligante em tempo real.

Imagem à direita: Típico sensorgrama mostrando a linha de base das fases, a associação, a dissociação e o retorno à linha de base.

Primeiro, como mostrado no sensorgrama, é determinada uma linha de base. Em poucas palavras, este é o índice de refração do ligante apenas. Em seguida, o analito não ligado na solução é adicionado, e a associação (ligação) é medida como uma alteração nesse índice de refração. Após a fase de associação, a solução contendo o analito não ligado é removida, e a desassociação é medida. Embora esteja correlacionado ao ligante e ao analito envolvidos e à força de sua interação, o nível de sinal em um sensorgrama reside na curvatura de suas fases de associação e dissociação em que as informações valiosas se encontram. Por exemplo, o efeito biológico desejado de um medicamento vinculado ao seu tempo de residência (fase de dissociação), em vez de somente à sua afinidade.

As medições com uma injeção única de analito em uma única concentração (cinética de ciclo único) são rápidas, mas não produzem estimativas confiáveis de todos os parâmetros cinéticos. Tradicionalmente, a cinética é medida em um experimento cinético de vários ciclos: a análise cinética confiável e detalhada requer dados de pelo menos quatro a seis concentrações de analito, abrangendo a faixa de 0,1 a 10 vezes a K_D esperada. Isso requer séries de diluição e etapas de desassociação entre os ciclos. Portanto, a cinética de vários ciclos consome muito tempo e não é adequada para a triagem de milhares de compostos candidatos. 

A cinética sem regeneração permite uma análise mais rápida por ignorar as etapas de regeneração. No entanto, a análise cinética sem regeneração só pode ser aplicada se o analito se dissociar lentamente, pois ela está condicionada a esse pequeno analito se dissociar durante os ciclos de concentração de analito crescente. Nós desenvolvemos um método de detecção revolucionário: Pulsos de analito de duração crescente - waveRAPID: isso reduzirá drasticamente o tempo de ensaio e o consumo de reagentes, ao mesmo tempo em que melhorará a leitura para identificar os leads no processo de descoberta de medicamentos mais rapidamente e com maior confiança. 

O waveRAPID utiliza pulsos de analito em uma única concentração, mas cada pulso é aplicado para aumentar a duração. Veja como nossos métodos podem ajudar a obter dados cinéticos de maneira mais rápida e fácil: o método waveRAPID recém-desenvolvido e o software Direct Kinetics, que fornece uma ferramenta de avaliação em um clique.

Com o lançamento do WAVEsystem, a Malvern Panalytical agora oferece também um biossensor óptico para estudo da cinética de ligação em tempo real. 

O WAVEsystem pode ser usado para fornecer respostas a uma ampla gama de questões científicas. Isso inclui determinar se duas moléculas estão interagindo e qual é a afinidade de ligação das moléculas (K_D), bem como confirmar a concentração biologicamente ativa de um analito específico em uma amostra. 

Além disso, o WAVEsystem pode medir os parâmetros de reação cinética, como a constante da taxa de associação (k_a) e a constante da taxa de dissociação (k_d), observando a ligação analito-ligante em tempo real. 

Visite nossa página sobre a técnica GCI para conferir por que o WAVEsystem com sua técnica GCI própria apresenta resolução superior em relação à tradicional Ressonância plasmática de superfície (SPR) e à Interferometria de biocamada (BLI).