Nesta nota técnica, mostramos como o WAVE da Creoptix pode ser usado para medir a interação de um agonista de ligante peptídico (NTA11) com uma variante termoestabilizada do receptor neurotensina 1 (NTSR1) na resolução mais alta.
Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) compreendem uma grande classe de proteínas integrais de membrana, cruciais para a transdução de estímulos extracelulares através da membrana plasmática para provocar respostas moleculares e celulares. Eles regulam uma variedade de processos fisiológicos em eucariontes e representam o maior grupo de metas terapêuticas, com mais de 30% dos produtos farmacêuticos disponíveis visando aos GPCRs.
As proteínas da membrana são notoriamente difíceis de estudar devido à necessidade de um ambiente que simule a membrana e sua instabilidade uma vez extraída de uma membrana celular. Mostramos aqui a capacidade do WAVE da Creoptix de medir a interação de um agonista de ligante peptídico (NTA11) com uma variante termoestabilizada do receptor neurotensina 1 (NTSR1)1 na resolução mais alta. Esse GPCR media as várias funções da neurotensina, como hipotensão, hiperglicemia, hipotermia, antinocicepção e regulação da motilidade e secreção intestinais2.
O receptor foi biotinilado in vivo via avi-tag e capturado em um sensor pré-revestido de estreptavidina (WAVEchip DXH-STA). Para o agonista peptídico medido, utilizou-se uma forma mutada e truncada de neurotensina (Mw 725 Da), compreendendo os resíduos de 8 a 13 com substituição de Y11A. As curvas dose-resposta foram registradas para 7 concentrações diferentes de analitos de uma série de diluição de 3 vezes com 300 nM sendo a concentração mais alta. A taxa de fluxo foi definida para 30 μL/min. O tampão de corrida foi de 50 mM Tris pH 7,5, 150 mm de NaCl e 0,1% (w/v) do detergente lauril neopentilglicol maltose (L-MNG)3. Todas as medições foram realizadas a 25 °C.
O receptor neurotensina purificado e biotinilado foi capturado em um sensor pré-revestido de estreptavidina (WAVEchip DXH-STA) com densidade de 1350 pg/mm2. Foram registradas curvas dose-resposta para ligação de agonista peptídico (Figura 1), gerando dados de ligação que poderiam ser bem ajustados com um modelo para uma interação 1:1, incluindo um termo para transporte de massa (MTL). As taxas cinéticas obtidas e a constante de equilíbrio estão resumidas na Tabela 1.
Rmáx (pg/mm2) | kassociado (M-1.s-1) | kdissociado (s-1) | KD (nM) | |
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Determinação cinética | 17,982 | 1,681 x 106 | 3,49 x 10-2 | 20,8 |
Determinação de equilíbrio | 22,083 | - | - | 42,6 |
Tabela 1: taxas cinéticas e constante de dissociação para o agonista NTA11 obtidas com um modelo de interação 1:1 incluindo um termo para limitação de transporte de massa (MTL)