Afinidade de ligação

A afinidade de ligação é a força da interação de ligação entre uma única biomolécula (ex.: proteína ou DNA) e seu ligando/parceiro de ligação (ex.: droga ou inibidor). A afinidade de ligação é normalmente medida e reportada pela constante de dissociação de equilíbrio (K_D), que é usada para avaliar e classificar as forças da ordem de interações biomoleculares. Quanto menor o valor de K_D , maior a afinidade de ligação do ligando e seu alvo. Quanto maior o valor de K_D , menor a atração e a ligação da molécula alvo e da ligadura umas às outras. 

A afinidade de ligação é influenciada por interações intermoleculares não covalentes, como a ligação do hidrogênio, as interações eletrostáticas e as forças de Van der Waals entre as duas moléculas. Além disso, a afinidade de ligação entre um ligante e sua molécula alvo pode ser afetada pela presença de outras moléculas.

Sempre que você estiver caracterizando proteínas, ácidos nucleicos e qualquer biomolécula, entender a afinidade de ligação a substratos, inibidores e cofatores é fundamental para a apreciação das interações intermoleculares relevantes no estudo, por exemplo, de reações enzimáticas, complexos de proteínas ou ligação a receptores. Para a descoberta de drogas, a afinidade de ligação ajuda a projetar medicamentos que se ligam a seus alvos de forma seletiva e específica.

Há muitos métodos para medir a ligação. Métodos qualitativos (ou seja, ligação: sim/não), como ELISA, ensaios de deslocamento de gel e métodos quantitativos (ou seja, afinidade de ligação), como ensaios espectroscópicos, biossensores ópticos (como GCI) e calorimetria de titulação isotérmica.

Existem muitas maneiras de medir a afinidade de ligação, incluindo métodos que exigem que os interagentes sejam rotulados e abordagens sem rótulos. O principal método qualitativo rotulado (ou seja, ligação: sim/não) é o ensaio imunoenzimático (ELISA). Os principais métodos quantitativos sem rótulo incluem ensaios espectroscópicos, calorimetria de titulação isotérmica (ITC) ou biossensores ópticos, como ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e interferometria acoplada a rede (GCI).

Ensaio imunoabsorvente enzimático (ELISA)

ELISA é uma técnica de ensaio baseada em placas que utiliza um ligante imobilizado para capturar um analito alvo da solução e utiliza reagentes de detecção especializados (os rótulos) para analisar a reação entre as duas moléculas.

Ressonância plasmônica de superfície (SPR)

SPR é uma técnica de detecção óptica sem rótulo que detecta interações moleculares à medida que o índice de refração muda dentro de um campo evanescente localizado do plasmon de superfície. Canais microfluídicos permitem medições mais precisas.

Interferometria de biocamada (BLI)

O BLI usa um biossensor óptico para medir mudanças no padrão de interferência da luz refletida na ponta do biossensor. A ponta do biossensor é normalmente revestida com uma molécula de captura e mergulhada em uma solução de amostra contendo o analito de interesse. BLI não tem rótulo.

Interferometria acoplada a grade (GCI)

GCI é uma técnica de detecção óptica sem rótulo que envolve o acoplamento de uma amostra e um feixe de referência em um guia de ondas de fibra óptica. A afinidade de ligação e a cinética são analisadas medindo os sinais de mudança de fase dependentes do tempo que resultam da interação.

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC)

O ITC mede a mudança de calor associada à interação de ligação e determina sua estequiometria e termodinâmica de ligação.

Independentemente de como você mede a afinidade de ligação, a medição resultará em vários pontos de relatório, a partir dos quais uma curva de afinidade de ligação pode ser criada. Esta curva depende da concentração da amostra e da interação entre a amostra e o alvo.

Isto torna importante conhecer a concentração da sua amostra e considerar o período de incubação correto, além dos controles experimentais regulares e adequados. É particularmente importante atingir o equilíbrio (onde a quantidade de moléculas que se ligam ao alvo é igual à quantidade que se desassocia do alvo) durante o ensaio. Sem atingir o equilíbrio, não é possível determinar com segurança a afinidade, pois o modelo de ligação não pode ser ajustado de forma confiável.

Saiba mais em nosso Guia de Cinética.

A Malvern Panalytical oferece Interferometria acoplada a grade (GCI) e Calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Ambas as técnicas são sem marcadores, permitindo o uso de moléculas nativas. A afinidade altamente quantitativa (valores de K_D) pode ser derivada de ambas para uma ampla variedade de interações.

A GCI é um método óptico que mede a mudança no índice de refração em um campo evanescente causado pelo evento de ligação e é usado para estudar a afinidade cinética de uma interação. A GCI mede os valores de K_D na faixa de milimolar a picomolar e, adicionalmente, determina a cinética de uma interação, mais especificamente, as taxas de ativação (k_a) e desativação (k_d).

A ITC mede a mudança de calor associada ao evento de ligação. A ITC mede valores de K_D no intervalo milimolar a nanomolar e determina a estequiometria de ligação e a termodinâmica das interações. Tanto a cinética quanto a termodinâmica são importantes na caracterização das interações intermoleculares. 

A afinidade de ambos os dispositivos é ortogonal e, em conjunto, pode fornecer confiança quando um K_D altamente quantitativo é necessário, por exemplo, em aplicativos de otimização de leads, entre outros. 

A GCI se beneficia de uma maior sensibilidade, maior rendimento e menor consumo de amostra e funciona bem com amostras brutas. Se esses fatores e as informações cinéticas são os mais importantes para sua aplicação, então esse é claramente o instrumento de escolha. 

Se os dados termodinâmicos (entalpia e entropia) e a estequiometria são os mais importantes, então a ITC é a melhor solução. A ITC também se beneficia do desenvolvimento mínimo do ensaio e, portanto, pode ser mais rápida para obter um resultado se apenas um pequeno número de medições de um determinado par de interação for antecipado. A técnica também não é destrutiva e a amostra pode ser recuperada após o experimento. 

O WAVEsystem (GCI) e o MicroCal PEAQ-ITC são projetados tendo em mente o usuário e têm comprovação para facilidade de uso em suas respectivas classes de instrumentos.