在本技術說明中，我們將示範如何使用 Creoptix WAVE 來瞭解 Sybody® 候選物鍵結至 SARS-CoV-2 接收器鍵結區 (RBD) 的動力學，兩者皆由 Linkster Therapeutics AG 和蘇黎世大學所提供。具備高靈敏度與可靠微流道，Creoptix WAVE 適用於競爭分析、確認並豐富 ELISA 數據。透過為抑制測定提供快速動力學特性分析，在使用 leadXpro 所提供的 ACE2 下，WAVE 可加速 SARS-CoV-2 治療之發展。
不同於傳統小分子藥物產品，其通常以單一化學個體存在，生物製劑如抗體、奈米抗體和其他在活體系統中製造的大分子是高度複雜的。這也會使得其特性分析充滿挑戰，特別是因為許多生物製劑藥物會以多種不同的變異型式存在，其性質和含量會嚴重受到製造過程的影響。在當前的新冠病毒疫情期間，合成單一配位體抗體 (又稱為奈米抗體或 Sybody) 可能是 COVID-19 預防性治療發展之關鍵，因為它們相當適合以吸入式奈米抗體劑型進行肺部投予治療。1
鍵結親和力 可說是生物製藥，如 Sybody 分子，最廣泛研究的特性之一。但除非能與藥物其他特質一同評估，否則鍵結親和力亦無法提供足夠資訊來預測臨床療效。生物藥物開發的全面特性分析，也應包括鍵結動力學的即時分析，透過準確測量抗體與標的物之間交互作用結合和解離速率。
憑藉無阻塞微流道及優於傳統表面電漿共振 (SPR) 技術的優異靈敏度，可更準確地測量鍵結親和力和鍵結動力學，我們在此展示了 Creoptix WAVE 如何推動生物製劑開發，透過提供 Sybody 候選物對 SARS-CoV-2 棘蛋白上受體鍵結區 (RBD) 的鍵結親和力和選擇性等深入見解。
生物素化 RBD-vYFP 在 Streptavidin PCP-STA WAVEchip 上進行擷取 (聚羧酸準平面表面；Creoptix AG)，密度為 1000 pg/mm2。接著，會將 ACE2 以漸增濃度注入加有 0.05% Tween-20 (TBST) 的 TBS 緩衝液，範圍為 6.25 nM 到 400 nM (兩倍連續稀釋，7 個濃度)。ACE2 以流動速率 15 μl/min 在每個通道注入 360 秒，並將解離設定為 1200 秒，以允許其返回基線。感應圖在 25°C 下進行記錄，並在 WAVEcontrol 上分析數據。透過減除空白注入及參考通道的訊號為數據進行雙重參照。使用 Langmuir 1:1 模型進行數據擬合 (請參閱圖 1)。
選擇僅 Sybody (500 nM 於 TBST 中)、僅 ACE2 (250 nM 於 TBST 中) 或 Sybody (500 nM) 和 ACE2 (250 nM) 混合進行注入 300 秒，每次解離皆設定為 1200 秒，以確保其返回基線。感應圖在 25°C 下進行記錄，透過減除空白注入和參考通道的訊號進行雙重參照後，數據會使用 WAVEcontrol 覆加。
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圖 1：純化 ACE2 鍵結至生物素化棘突受體鍵結區 (biotinylated spike RBD) 的動力學
我們的合作是從收到由 Linkster Therapeutics AG 與 Markus Seeger 教授 (蘇黎世大學，微生物學醫學研究所) 使用 Sybody 平台建立的 57 個表現良好且獨特的 Sybody 候選物開始。2 因此，所有 Sybody 候選物都在 Creoptix WAVE 上進行解離速率篩檢，其識別出棘突受體鍵結區的六大強力鍵結。與 ELISA 數據一致，且能提供更多詳細動力學內容如結合速率及解離速率，隨後測得鍵結常數揭露其親和力落在 20-180 nM 之範圍。3 考量到它們之間緊密鍵結的特性，且其親和力與 ACE2/Spike 交互作用具相同範圍，我們決定進一步對六個 Sybody 候選物進行特性分析，調查其與 ACE2 競爭以鍵結至 Spike RBD 的能力。
Sybody 候選物與 ACE2 競爭以鍵結至 Spike RBD。由於 SARS-CoV-2 的病毒 Spike RBD 必須鍵結至人體 ACE2 才會有致病力，所以我們評估了選定 Sybody 候選物在同時注射下，抑制 ACE2 與 Spike RBD 鍵結的能力。
使用 Stretavidin PCP-STA WAVEchip 來擷取生物素化 Spike RBD，Sybody 候選物和純化 ACE2 以指定濃度單獨或合併注入。如圖 2E 所示，ACE2 在 Sybody 16 存在下幾乎喪失了與 Spike RBD 鍵結之能力，說明其具備絕佳抑制 ACE2 與 Spike 交互作用的能力。此抑制作用僅部分存在於 Sybody 3 或 Sybody 42 (分別為圖 2C 和 2D)，Sybody 67 則完全沒有作用 (圖 2B)。此 GCI 資料與先前發表的 ELISA 結果一致 (圖 2E)，具備在此類抑制測定中進行快速特性分析之優勢。使用此類型分析測定所收集到的證據，可支持 Sybody 候選物 3、16 和 42 可辨識與 ACE2 鍵結區重疊的 Spike RBD 表面區域之觀察。
![[Figure 2 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg] Figure 2 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg](https://dam.malvernpanalytical.com/ed6bb461-28e0-4b0d-b6b4-ae4000a09ea1/Figure%202%20TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD_Original%20file.jpg)
圖 2：Sybody 候選物與 ACE2 競爭以鍵結至 Spike RBD
簡言之，我們將在此示範 Creoptix WAVE 如何對源自於先前發表之 Sybody 資料庫的候選物進行快速特性分析，同時確認這些 Sybody 候選物如何抑制 ACE2-Spike 的交互作用。3 為 ELISA 數據提供快速正交驗證，透過加速對抗 SARS-CoV-2 的治療發展，Creoptix WAVE 是讓您領先瞭解 COVID-19 疫情的理想選擇。
瞭解治療發展的鍵結動力學並產出新資料數據，透過 Creoptix WAVE 來強化結果和發表：
適合：
SARS-CoV-2 biotinylated Spike RBD 蛋白質融合至 Venus YFP (RBD-vYFP) 與 Sybody 候選物由 Markus Seeger 教授 (IMM，蘇黎世) 和 Linkster Therapeutics AG 提供。純化、以組胺酸標記的人血管緊張素轉換酶 2 (ACE2) 之 ectodomain 由 Matthieu Botte 博士慷慨提供 (leadXpro)。
