結合親和性

アフィニティ解析

結合親和性は、単一の生体分子(タンパク質やDNAなど)とリガンド/結合パートナー(ドラッグや阻害剤など)との結合相互作用の強さを表します。結合親和性のアフィニティ解析は、2つの分子間の結合親和性、つまり結合する力の強さを定量的に分析する手法です。様々な分野で重要な役割を果たしており、特に創薬やバイオテクノロジーにおいて重要なツールとなっています。アフィニティ解析により平衡解離定数(K_D)を求められます。これは、生体分子の相互作用の強さの評価とランク付けに使用されます。K_D値が小さいほど、ターゲット分子とリガンドが互いに引き合い、ターゲットに対するリガンドの結合親和性が高くなります。K_D値が大きいほど、結合する力が弱くなります。 

結合親和性は、水素結合、静電気的相互作用、2分子間の疎水性およびファンデルワールス力など、非共有結合の影響を受けます。また、リガンドとターゲット分子の結合親和性は、他の分子の存在から影響を受ける可能性があります。

K_D値とは

K_D値は、平衡解離定数 (Dissociation Constant) の略称で、2つの分子が結合と解離を繰り返す際の平衡状態における結合の強さを表す指標です。

K_D値が小さいほど、結合親和性が高いことを意味します。 K_D値は、以下の式で表されます。

K_D = [A][B]/[AB]

[A]：自由な分子Aの濃度
[B]：自由な分子Bの濃度
[AB]：結合した分子ABの濃度

K_D値の解釈

K_D値は、結合親和性の指標ですが、以下の点に注意する必要があります。 

• K_D値は、温度、pH、イオン強度などの条件によって変化します。 
• K_D値は、in vitroでの測定値であり、in vivoでの実際の相互作用とは異なる場合があります。

カイネティクス解析

• 2つの分子間の結合の強さ
• 結合と解離の速度
• 結合の熱力学的性質
• 分子間相互作用のメカニズムの詳細

結合親和性は、2つの分子が結合する力の強さを表す指標です。結合親和性を測定するには、相互作用分子の標識を必要とする方法や標識を使用しないアプローチなど、多くの方法があります。主な標識定性法 (結合のあり/なし) はELISA（酵素結合免疫吸着検定法 ） です。主要なラベルフリーの定量法には、分光アッセイ、ITC、またはSPR（表面プラズモン共鳴）、 BLI（バイオレイヤー干渉法）、GCI（グレーティング結合干渉法) などの光学バイオセンサーが含まれます。

ELISA（酵素免疫測定法）

ELISA は、固定化リガンドを使用して溶液から標的分析物を捕捉し、特殊な検出試薬 (ラベル) を使用して 2 つの分子間の反応を分析するプレートベースのアッセイ技術です。

SPR（表面プラズモン共鳴）

SPR は、表面プラズモンの局在エバネッセント場内での屈折率変化として分子相互作用を検出する、ラベルフリーの光学センシング技術です。マイクロ流体チャネルにより、より正確な測定が可能になります。

BLI（生物層干渉法）

BLI は、光学バイオセンサーを使用して、バイオセンサー チップから反射された光の干渉パターンの変化を測定します。バイオセンサーチップは通常、捕捉分子でコーティングされ、対象の分析物を含むサンプル溶液に浸されます。 BLI はラベルフリーです。

 GCI（回折格子結合干渉計）

GCI は、サンプルと参照ビームを光ファイバー導波路に結合するラベルフリーの光学センシング技術です。結合親和性と反応速度は、相互作用から生じる時間依存の位相シフト信号を測定することによって分析されます。

 ITC（等温滴定熱量測定）

ITC は、結合相互作用に関連する熱変化を測定し、結合の化学量論と熱力学を決定します。

どのような方法で結合親和性を測定しても、測定結果は複数のレポートポイントを取得し、そこから結合親和性曲線を作成します。この曲線は、サンプルの濃度と、サンプルとターゲット間の相互作用の両方に依存します。

このため、定期的に適切な実験コントロールに加え、サンプルの濃度を把握し、適切なインキュベーションタイムを考慮することが重要になります。アッセイ中に平衡状態（ターゲットに結合する分子の量がターゲットから解離する量と同じになる状態）に達することが特に重要です。平衡に達しないと結合モデルを確実に適合させることができないため、親和性を確実に決定することはできません。

詳細については、Kinetics Guideをご覧ください。

Malvern Panalyticalは、グレーティング結合干渉法(GCI)と等温滴定型カロリメトリー(ITC)の両方を提供しています。どちらの手法もラベルフリーであり、天然分子を使用できます。幅広い相互作用について、高度に定量的な親和性(K_D値)が両方から得られます。

GCIは、結合イベントによって発生するエバネッセント場の屈折率の変化を測定する光学的手法であり、相互作用の親和性とカイネティクスの研究に使用されます。GCIでは、mMからpMの範囲でK_D値を測定し、さらに相互作用のカイネティクスを決定します。具体的には、オン(k_a)およびオフ(k_d)の速度を決定します。

ITCは、結合イベントに関連する熱変化を測定します。ITCではK_D値をmMからnMの範囲で測定し、相互作用の結合比とサーモダイナミクスも決定します。分子間相互作用の特性評価では、カイネティクスとサーモダイナミクスの両方が重要です。  

両方の装置から得られる親和性は直交しているため、特にリード分子の最適化用途で高度に定量的なK_Dが必要な場合に、信頼性を高めることができます。 

GCIは、感度とスループットが高く、サンプル消費量が少ないのに加え、クルードなサンプルでも良好に動作します。これらのファクターとカイネティクス情報が測定目的で最も重要である場合は、GCIは最適な装置と言えます。 

サーモダイナミクスデータ(エンタルピーとエントロピー)と結合比が最も重要な場合は、ITCが最適なソリューションです。また、ITCはアッセイ開発を最小限に抑えることができるため、特定の相互作用ペアのサンプル測定数が少ない場合は、迅速に結果が得られます。また、この手法は非破壊で、サンプルは実験後に回収できます。

WAVEsystem  (GCI)と MicroCal PEAQ-ITC は、どちらもユーザー様を念頭に置いて設計されていて、使いやすさに定評があります。 

結合親和性評価のアプリケーション事例