Sars-CoV-2スパイクRBDに結合するSybody®候補の解明

はじめに

従来の単一の化学物質として存在する低分子医薬品とは異なり、抗体やナノボディなどの生物製剤や、生体内で生成されるその他の大型分子は極めて複雑です。特に、多くのバイオ医薬品は複数の変異体として存在し、その性質と存在量は製造プロセスに大きく影響されるため、特性評価が困難です。現在のコロナウイルスパンデミックの中で、合成単一ドメイン抗体(ナノボディまたはSybodyとも呼ばれる)は、吸入ナノボディ製剤の形で肺送達に適するため、COVID-19予防治療薬開発の鍵となる可能性があります。¹

結合親和性 は、Sybody分子のような生物学的特性の中で最も広く研究されている特性の1つです。しかし、薬剤の他の品質と一緒に評価されない限り、結合親和性は臨床効果を予測するための十分な情報を提供できません。生物学的製剤開発における包括的な特性評価には、抗体標的相互作用の結合速度および解離速度を正確に測定することで、結合反応速度のリアルタイム分析も含める必要があります。

Creoptix WAVEは、非凝固マイクロ流体と従来のSurface Plasmon Resonance (SPR)技術よりも優れた感度を使用して、結合親和性と結合反応速度をより正確に測定できます。ここでは、Creoptix WAVEが、SARS-COV-2 Spikeタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)領域に対するSybody候補の結合親和性と選択性に関する知見を提供することで、生物製剤開発をどう促進するのかについて説明します。

材料と方法

ACE2結合反応速度

ビオチン化RBD-vYFPは、ストレプトアビジンPCP-STA WAVEchip (ポリカルボン酸塩準平面、Creoptix AG)に、1000 pg/mm²の密度で捕捉されました。ACE2を、0.05% Tween-20 (TBST)を添加したTBS緩衝液中に、6.25～400 nM (2倍希釈、7つの濃度)の範囲で上昇する濃度により注入しました。ACE2はチャネルあたり15 μl/分の流量で360秒間注入し、ベースラインに戻るよう解離を1200秒に設定しました。センサグラムは25°Cで記録され、データはWAVEcontrolで解析されました。データは、ブランク注入と基準チャネルから信号を減算することで二重参照されています。データフィッティングにはLangmuir 1:1モデルを使用しました(図1を参照)。 

ACE2競合

選択したSybody (TBSTで500 Nm)のみ、ACE2 (TBSTで250 Nm)のみ、またはSybody (500 Nm)とACE2 (250 Nm)の混合物を300秒間注入し、ベースラインに戻るよう解離を1200秒間に設定しました。センサグラムは25°Cで記録され、データは、ブランク注入および参照チャネルから信号を減算し、二重参照後のWAVEcontrolを使用してオーバーレイされています。 

図1: ビオチン化したスパイクRBDへの精製ACE2の結合反応速度

結果

研究履歴

当社のコラボレーションは、Linkster Therapeutics AGとMarkus Seeger教授(チューリッヒ大学医学微生物学研究所)がSybodyプラットフォームを使用して作成した、57の優れた挙動を持つ独自のSybody候補を獲得したことから始まりました。² このため、すべてのSybody候補にCreoptix WAVE上でオン/オフレートスクリーニングを実施し、スパイクRBDに対して6つの強力なバインダーを同定しています。ELISAデータとの一致、および詳細な動的詳細のオン/オフレートの提供により、結合定数を特定し、20～180 Nmの範囲内で親和性を明らかにしました。³ 強い結合特性を持ち、ACE2/スパイクとの相互作用と同じ範囲内にある親和性を持つことから、6つのSybody候補の特性をさらに評価し、ACE2のスパイクRBDへの結合能力と競合する能力を調査することを決定しました。

スパイクRBDへのACE2の結合能力と競合するSybody候補。SARS-COV-2の毒性は、ウイルス性スパイクRBDとヒトACE2との結合を必要とするため、選択したSybody候補のスパイクRBDへのACE2結合を抑制する機能を混注時に評価しました。 

ビオチン化スパイクRBDを捕捉するためにストレプトアビジンPCP-STA WAVEchipを使用し、Sybody候補および精製ACE2を単独または組み合わせ、規定濃度で注入しました。図2Eにおいて、スパイクRBDへのACE2の結合は、Sybody 16の存在下でほぼ完全に排除され、ACE2-スパイク相互作用の極めて高い抑制レベルを示しています。この抑制は、Sybody 3またはSybody 42 (図2Cおよび2D)では部分的に存在し、Sybody 67 (図2B)では完全に無効です。このGCIデータは、事前に報告されたELISA結果(図2E)と一致しており、この抑制アッセイは迅速に特性評価できます。これらのタイプの解析アッセイを使用して収集された証拠は、Sybody候補3、16、42がACE2結合部位と重なるスパイクRBDの表面領域を認識する観察をサポートしています。 

図2: ACE2のスパイクRBDへの結合と競合するSybody候補

結論

Creoptix WAVE が、事前に公開されたSybodyライブラリに由来する候補を迅速に特性評価する方法、また、これらのSybody候補がACE2-スパイクの相互作用を抑制する方法について説明しました。 ³ 高速で直交的なELISAデータ検証が可能なCreoptix Waveは、SARS-CoV-2の治療薬開発を促進し、他社に先駆けてCOVID-19パンデミックを理解する上で理想的な装置です。

重要事項

Creoptix WAVE を使用することで、治療薬開発の結合動力学を理解し、新しいデータを生成し、優れた測定結果を取得して公開することができます。 

• 迅速に知見をもたらす抑制アッセイ : 結合を特性評価し、迅速に競合力学を理解できます。 
• ELISA結果の検証 : 競合アッセイのデータ相関を確実に実現します。

以下の用途に最適です。

• 吸入製剤の開発
• エピトープマッピング
• ELISAデータの直交的な検証

謝辞

Venus YFP (RBD-vYFP)とSybody候補を融合させたSARS - COV-2ビオチン化スパイクRBDタンパク質は、Markus Seeger教授(IMM、チューリッヒ)およびLinkster Therapeutics AGから提供されました。ヒトアンジオテンシン変換酵素2 (ACE2)の精製済みHisタグ付き細胞外ドメインは、Matthieu Botte博士(leadXpro)から提供されました。

引用文献

1. van Heeke, G. et. al.2017.Nanobodies as inhaled biotherapeutics for lung diseases.Pharmacol Ther.169, 47-56. doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.06.012 
2. Zimmermann, I. et al.2018.Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife 7:e34317. doi: 10.7554/eLife.34317
3. Walter, J.D. et al.2020.Sybodies targeting the SARS-CoV-2 receptor-binding domain. bioRxiv doi: 10.1101/2020.04.16.045419