Bindungskinetik eines GPCRs

Einführung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Klasse integraler Membranproteine, die für die Weiterleitung extrazellulärer Reize über die Plasmamembran entscheidend sind, um molekulare und zelluläre Reaktionen hervorzurufen. Sie regulieren eine Vielzahl von physiologischen Prozessen in Eukaryoten und stellen die größte Gruppe therapeutischer Ziele dar, wobei mehr als 30 % der verfügbaren Arzneimittel auf GPCRs abzielen.

Membranproteine sind bekanntermaßen schwierig zu untersuchen, da sie eine membranähnliche Umgebung benötigen und instabil sind, sobald sie aus einer Zellmembran extrahiert worden sind. Wir zeigen hier die Fähigkeit des Creoptix WAVE, die Wechselwirkung eines Peptidliganden-Agonisten (NTA11) mit einer thermostabilisierten Variante des Neurotensin-Rezeptors 1 (NTSR1)¹ mit höchster Auflösung zu messen. Dieser GPCR vermittelt die vielfältigen Funktionen von Neurotensin, z. B. Hypotonie, Hyperglykämie, Hypothermie, Antinozizeption und Regulierung der Darmbeweglichkeit und -sekretion².

Materialien und Methoden

Der Rezeptor wurde in vivo über ein avi-Tag biotinyliert und auf einem mit Streptavidin vorbeschichteten Sensor (WAVEchip DXH-STA) erfasst. Für den gemessenen Peptidagonisten wurde eine mutierte und verkürzte Form von Neurotensin (MW 725 Da) verwendet, die die Reste 8-13 mit einer Y11A-Substitution enthält. Die Dosiswirkungskurven wurden für sieben verschiedene Analytkonzentrationen einer dreifachen Verdünnungsreihe aufgezeichnet, wobei 300 nM die höchste Konzentration war. Die Durchflussrate war auf 30 μl/min eingestellt. Der Laufpuffer bestand aus 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,1 % (W/V) des Reinigungsmittels Laurylmaltose-Neopentylglykol (L-MNG)³. Alle Messungen wurden bei 25 °C durchgeführt.

Ergebnisse

Gereinigter und biotinylierter Neurotensin-Rezeptor wurde mit einem Streptavidin-vorbeschichteten Sensor (WAVEchip DXH-STA) bei einer Dichte von 1350 pg/mm² erfasst. Es wurden Dosiswirkungskurven für die Bindung des Peptidagonisten aufgezeichnet (Abbildung 1), die Bindungsdaten ergaben, die mit einem Modell für eine 1:1-Wechselwirkung einschließlich eines Terms für den Massentransport (MTL) gut angepasst werden konnten. Die ermittelten kinetischen Raten und die Gleichgewichtskonstante sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Abbildung 1: Sensorgramme der Wechselwirkung zwischen einem modifizierten Neurotensin-Peptid (MW 725 Da) als Analyt und einem thermostabilisierten Neurotensin-Rezeptor (NTSR1, 70 kDa Protein-/Reinigungsmittelkomplex) als Ligand. Die Daten wurden mit einem Modell für eine 1:1-Wechselwirkung einschließlich eines Terms für die Massentransportbegrenzung (MTL) unter Verwendung der WAVEcontrol Software angepasst.

Tabelle 1: Kinetische Raten und Dissoziationskonstante für den NTA11-Agonisten, ermittelt mit einem 1:1-Wechselwirkungsmodell, einschließlich eines Terms für die Massentransportbegrenzung (MTL)

Literatur:

1. Egloff, P., Hillenbrand, M., Klenk, C., Batyuk, A., Heine, P., Balada, S., Schlinkmann, K. M., Scott, D. J., Schütz, M. und Plückthun, A. (2014) Structure of signaling-competent neurotensin receptor 1 obtained by directed evolution in Escherichia coli. (Struktur des signalfähigen Neurotensin-Rezeptors 1, gewonnen durch gerichtete Evolution in Escherichia coli). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, E655–62.
2. Krumm, B. E. und Grisshammer, R. (2015) Peptid Ligand Recognition by G Protein-coupled rezeptors. (Peptid-Liganden-Erkennung durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren). Front. Pharmacol. 
3. Chae, P. S., Rasmussen, S. G. F., Rana, R. R., Gotfryd, K., Chandra, R., Goren, M. a, Kruse, A. C., Nurva, S., Loland, C. J., Pierre, Y., Drew, D., Popot, J., Picot, D., Fox, B. G., Guan, L., Gether, U., Byrne, B., Kobilka, B., und Gellman, S. H. (2010) Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization, stabilization and crystallization of membrane proteins. (Maltose-Neopentylglykol (MNG)-Amphiphile zur Solubilisierung, Stabilisierung und Kristallisierung von Membranproteinen). Nat. Methods 7, 1003–1008.