使用 DSC 进行生物治疗药物的预制剂及稳定性研究

简介

生物治疗药物治疗疾病在制药行业中的比重正日益增加，如抗体以及其他蛋白质分子。 由于生物治疗药物多要求高浓度、多剂量，因而生产商需制备千克或千克以上级蛋白药物。 生物治疗药物的生产工艺包括在数千升的生物反应器介质中进行蛋白表达，随后使用大规模的层析柱和过滤系统进行纯化。

蛋白质在生产条件下的稳定性、构象改变的可逆性及任何形成聚合物的可能性取决于 pH 值、缓冲液成分等因素。 充分认清这些因素对于选择合适的工艺条件、制剂以及制定分析方法是非常重要的。 在抗体纯化过程中可能导致蛋白不稳定的步骤包括: 蛋白质 A 柱的低 pH 值洗脱步骤，用于病毒灭活的低 pH 值保留步骤和所有其他需要调整 pH 和/或离子强度的步骤，包括最终制剂。

通过检测热跃迁中点温度，即 T_m，差示扫描量热法 (DSC) 可以提供不同 pH 值及不同共存溶质下蛋白质热稳定性的相关信息。 T_m 值越高反映出热稳定性越高，即长期稳定性越高。 本应用报告描述了 Diosynth Biotechnology 公司如何运用通过 DSC 获得的热稳定性数据，来表征用于预制剂研发的初始 pH 值/缓冲液筛选过程中的抗体稳定性以及生产工艺中使用的低 pH 病毒灭活工艺的优化。 如果低 pH 病毒灭活不造成任何蛋白质稳定性的下降，则其在蛋白质生产中是必需的步骤。

材料和方法

使用 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 系统进行 DSC 扫描。 预制剂研发中选用 pH 值范围在 3 到 8 之间的缓冲液。 蛋白质（X 抗体）分别存放于各缓冲液中，检测时间点为蛋白质与缓冲液接触时 (t = 0) 和蛋白质在缓冲液中储存一周时（t = 1 周）。

为对纯化条件进行优化，研究了 Y 抗体在中性三羟甲基氨基甲烷缓冲液（含有 NaCl 和 EDTA，pH 7.4）中的 DSC 热分析图，并将其与 pH 为 3 的柠檬酸缓冲液以及 pH 为 6 的柠檬酸缓冲液（添加 2M pH 为 9 的三羟甲基氨基甲烷以调节 pH 值）下的 DSC 热分析图进行比较。

利用 MicroCal VP-Capillary DSC 自带的 Origin™ 7.0 分析软件，在分析数据前已将缓冲液自身的热分析图从蛋白质的热分析图中扣除。

结果与讨论

预制剂研发中初始 pH/缓冲液的筛选

图 1 显示了 t = 0 时 X 抗体在预制剂研发初始研究的 19 种缓冲液中的主要 T_m 峰。 图 2 记录了此抗体在其中两种缓冲液中的 DSC 热分析图。 根据 Tm 值可知，抗体在 pH 5.0 到 pH 7.5 的缓冲液中稳定性最好。 在 t = 0 时，其他检测方法（UV、尺寸排阻色谱法 (SEC)、光散射和 SDS-PAGE）显示的不同缓冲液条件间的分辨率都低于 DSC（数据未显示）。

图 1：X 抗体在预制剂缓冲液中的 Tm 值范围。 样品使用 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 分析，t = 0。

如图 2 所示，T½ 值用于进一步比较不同的条件。 T½ 是指在 DSC 热分析图中主跃迁最大高度一半时的峰宽度，反映了热跃迁的协同性。 T½ 值越低表示蛋白结构越紧密，因而更益于配成制剂。 本实验中最低的 T½ 值见于 pH 为 5.5 到 6.5 之间的缓冲液（图 3）。

图 2：X 抗体在 t = 0 时的 DSC 热分析图。 (A) 溶于 pH 为 3 的柠檬酸缓冲液。(B) 溶于 pH 为 6.0 的琥珀酸缓冲液。 图中显示了 Tm 和 T½ 值。

图 3：X 抗体在预制剂缓冲液中主 Tm 值对应的 T½ 值范围，t = 0 和 t = 1 周。

低 pH 保留步骤和中和

pH 为 3 的柠檬酸缓冲液被选来用于将抗体从蛋白质 A 亲和柱上洗脱以及接下来的低 pH 值病毒灭活步骤。 由于大多数蛋白质长时间暴露于低 pH 环境时趋向于变得不稳定，因而一旦病毒灭活步骤完成，缓冲液 pH 值应立刻升高。

图 4、图 5 分别为抗体在中性缓冲液和 pH 为 3 的缓冲液中的 DSC 扫描图。

图 4：抗体在参照缓冲液（三羟甲基氨基甲烷、NaCl、EDTA，pH7.4）中的 DSC 热分析图。 DSC 热分析图显示三个热跃迁。 这是抗体常见的 DSC 热分析图。

图 5：抗体在低 pH 保留缓冲液（pH 3.0，柠檬酸缓冲液）中的 DSC 热分析图。 抗体在 pH 3.0 时的 DSC 热分析图显示因 T_m 值降低热稳定性降低：T_m¹ 值从 60.4ºC 降低至 48.0ºC，T_m² 从 73.3ºC 降低至 57.8ºC，T_m³ 在 pH 3.0 的缓冲液中消失。

上述两个热分析图在形状和谱型上都有所不同，表明抗体在 pH 3.0 的缓冲液中热稳定性下降。 与 pH 7.4 缓冲液相比，在 pH 3.0 缓冲液中，T_m² 跃迁峰的高度降低，峰宽增加，且第一、二次跃迁界限不明。

为模拟 pH 中和步骤，通过向抗体所在溶液添加 pH 9 的高浓度三羟甲基氨基甲烷溶液将其 pH 值调节至 6.0。 图 6 显示了这种最终得到的抗体溶液的热分析图。 此时，可见抗体稳定性相较 pH 3.0 缓冲液有所增加。 抗体在 pH 6.0 溶液中的 T_m² 与 T_m³ 值与之前参照缓冲液中的抗体 T_m²、T_m³ 值相似。 抗体在 pH 6 和 pH 7.4 的参照条件下两者的峰型、峰界、峰宽都很相似。

中和作用步骤也可添加组氨酸等稳定辅料。 在本实验中，加入组氨酸的抗体中和热分析图与图 6 几乎完全相同，显示组氨酸对该种抗体的稳定性无明显影响。

图 6：使用 pH 9.0 的 2 M 三羟甲基氨基甲烷溶液将 pH 3.0 调整至 pH 6.0 后的抗体 DSC 热分析图。

结论

本研究表明 DSC 可用于在预制剂研发过程中快速进行 pH 及缓冲液条件优化。 所得数据可为后来的辅料筛选选取合适的缓冲液及 pH 梯度，从而显著减少不必要的费时的条件探索。

DSC 也可用于检测低 pH 值病毒灭活阶段以及之后的 pH 3.0 到 6.0 的调节阶段抗体的稳定性。 这些有关抗体稳定性的资料对于生物药剂生产的设计和工艺优化十分有用。

致谢

相关数据由 FUJIFILM Diosynth Biotechnologies USA Inc 的 Kathrine E. 博 士友情提供。