NanoSight Pro F-NTA로 VSV-G 양성 렌티바이러스 식별

바이러스 벡터 제형 개발에서는 정제 과정이 효과적이고 모든 벡터가 예상대로 형성된다고 가정하는 경우가 많습니다. 그러나 항상 그런 것은 아닙니다. 특정 벡터 성분에 태그를 지정하여 해당 벡터 성분의 존재를 감지하고 확인할 수 있다면 어떨까요?

이 응용 노트에서는 NanoSight Pro의 형광 모드를 사용하여 정제된 샘플 내에서 특정 2단계 라벨링 과정을 사용하여 VSV-G 양성 렌티바이러스를 감지하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 렌티바이러스* 제형의 특성을 분석하기 위해 표면의 VSV-G를 타겟팅하여 나노입자 추적 분석(NTA) 기술을 활용하는 NanoSight Pro를 사용하는 것을 보여줍니다.

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소개

표면의 VSV-G 타겟팅

샘플 내 불순물과 기타 성분으로부터 렌티바이러스를 분리하고 특성을 분석하기 위해 VSV-G 단백질을 타겟팅하는 렌티바이러스에 특정 라벨링을 수행했습니다. 1차 항체와 2차 항체를 활용한 2단계 라벨링 과정. Anti-VSV-G 1차 항체(Leander 세부 정보)는 렌티바이러스 표면의 VSV-G 수용체에 결합합니다. 복합 형광체가 연결된 다음 2차 항체는 1차 항체에 연결됩니다(그림 1).

[그림 1 v2 AN241016-nanosight-pro-vsv-g-identification.png] 그림 1 v2 AN241016-nanosight-pro-vsv-g-identification.png

그림 1: 1차 항체 및 2차 형광 항체를 이용한 렌티바이러스 2단계 라벨링 도식

방법

먼저 렌티바이러스를 1차 Anto-VSV-G 항체와 함께 실온에서 30분 동안 배양했습니다. 다음으로, Alexa 488 형광체와 연결된 2차 항체를 라벨링 혼합물에 첨가하고 실온에서 20분간 더 배양했습니다(그림 1). 라벨링된 샘플과 라벨링되지 않은 대조군 모두 Alexa488 excitation 및 형광 신호 수집에 가장 적합한 구성으로 488nm 레이저와 500LP 형광 필터가 장착된 NanoSight Pro를 사용하여 분석했습니다.

데이터는 라벨링된 샘플, 1차 항체만 있는 렌티바이러스 대조군, 2차 항체만 있는 대조군, 라벨링되지 않은 대조군 모두에 대해 NS Xplorer 1.1 소프트웨어를 사용하여 광 산란 및 형광 모드에서 수집했습니다. 라벨링된 샘플과 라벨링되지 않은 대조군의 크기 분포 형식의 출력을 비교하여 그림 2에 표시했습니다.

결과

[그림 2 v2 AN241016-nanosight-pro-vsv-g-identification.png] 그림 2 v2 AN241016-nanosight-pro-vsv-g-identification.png

그림 2: 라벨링된 렌티바이러스와 라벨링되지 않은 대조군의 크기 분포 오버레이

라벨링 결과 대부분의 입자가 VSV-G 양성으로 나타났으며, 50nm~150nm 크기 범위에서 74%의 라벨링 효율을 보이며 특정 태그가 부착된 벡터의 비율을 나타냅니다(그림 2, 녹색 선). 샘플의 라벨링되지 않은 입자는 VSV-G 성분을 포함하지 않을 가능성이 높으며, 공동 정제된 세포 외 소포, 단백질 또는 기타 불순물을 나타낼 수 있습니다.

라벨링된 샘플과 라벨링되지 않은 샘플(그림 2, 주황색 선)의 광 산란 크기 분포 프로파일 및 역가/농도(표 1)는 유사하게 유지되었으며(그림 2, 파란색 선), 이는 라벨링 과정이 렌티바이러스의 물리화학적 속성을 변화시키지 않았음을 나타냅니다.

라벨링의 특이성을 확인하기 위해 1차 및 2차 항체가 있는 렌티바이러스 관련 대조군을 라벨링된 샘플과 동일한 조건에서 실행했습니다. 대조군의 크기 분포 비교는 아래의 그림 3에 나와 있습니다.

[그림 3 v3 an241016-nanosight-pro-vsv-g-identification.png] 그림 3 v3 an241016-nanosight-pro-vsv-g-identification.png

그림 3: 렌티바이러스 대조군의 크기 분포 오버레이

렌티바이러스 대조군과 1차 항체(그림 3, 빨간색 선) 및 2차 항체(그림 3, 노란색 선)의 크기 분포는 광 산란에서 라벨링되지 않은 샘플과 라벨링된 샘플과 일치했습니다. 전체 샘플 농도는 라벨링되지 않은 대조군과 항체 대조군에서도 비슷하게 유지되었습니다(표 1). 두 항체 대조군 모두에서 NTA 형광 신호가 검출되지 않았습니다. 이러한 결과는 비특이적 결합 가능성을 배제하고 렌티바이러스 입자 표면에 제시된 VSV-G 표적에 1차-2차 항체가 성공적으로 결합했다는 것을 확인시켜 줍니다.

광 산란 모드	렌티바이러스 라벨링되지 않은 대조군	1차 항체 2차 항체로 라벨링된 렌티바이러스	1차 항체 대조군이 있는 렌티바이러스	2차 항체 대조군이 있는 렌티바이러스
농도/역가[입자/ml]	2.39E11	2.08E11	2.41E11	2.33E11
모드[nm]	103	107	108	78
평균[nm]	108	113	161	137

표 1: 렌티바이러스 라벨링되지 않은 대조군, 렌티바이러스 1차 항체 및 2차 항체 대조군, 라벨링된 샘플의 광 산란 데이터 요약입니다.

요약

렌티바이러스 표면에서 특정 성분의 태그를 지정할 수 있는 2단계 라벨링에 성공했습니다. NanoSight Pro는 광 산란 모드에서 전반적인 샘플 특성을 빠르게 확인했습니다. 또한 형광 모드에서 VSV-G 양성을 보이는 렌티바이러스 하위 집단을 구별했습니다. 이러한 특정 라벨링과 형광 특성 분석 기술은 바이러스 벡터 식별에 한 걸음 더 가까워지게 합니다.

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이 응용 노트는 5개 파트로 구성된 시리즈의 일부입니다. 이 주제에 대해 더 깊이 이해하고 싶다면 나머지 시리즈를 살펴보세요.

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*렌티바이러스 및 MVA 샘플과 제형 버퍼는 Malvern Panalytical의 협력업체 중 한 곳에서 흔쾌히 제공했습니다.