NanoSight Pro 형광 모드로 바이러스 벡터 제형을 특성화

소개

세포 거동을 검출하고 연구하는 일반적인 방법은 형광 검출이며, 이는 훨씬 더 작은 바이러스 벡터를 특성화하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이 응용 노트에서는 친유성 염료를 사용한 멤브레인 라벨링을 사용하여 NanoSight Pro 형광 모드로 바이러스 벡터 제형의 특성화하는 방법을 설명합니다.

바이러스 벡터 멤브레인 라벨링 

이 연구는 나노 입자 추적 분석(NTA) 기술을 활용하여 렌티바이러스* 및 MVA* 제형을 특성화하는 NanoSight Pro의 사용을 보여줍니다.

지질막을 포함하는 입자의 존재를 확인하기 위해 일반적인 멤브레인 라벨링을 수행했습니다. 1mg/ml 농도의 친유성 카보시아닌 염료 DiO(DIOC18(3))를 실온에서 15분 동안 렌티바이러스 또는 MVA 샘플와 함께 배양했습니다(그림 1 및 2). 다음으로 두 샘플을 NTA 분석을 위해 최적의 농도로 PBS에 희석했습니다. 샘플은 DiO 및 형광 신호 수집에 가장 적합한 구성으로 488nm 레이저와 500LP 형광 필터가 장착된 NanoSight Pro로 분석했습니다.

그림 1: 렌티바이러스를 DiO로 표지하는 개략도

그림 2: DiO를 사용한 MVA 라벨링 개략도

DiO로 라벨링 된 샘플과 라벨링 되지 않은 대조군에 대해 광산란 및 형광 모드에서 데이터를 수집했습니다. 렌티바이러스 및 MVA 제형의 얻어진 크기 분포는 그림 3 및 4에 나와 있습니다.

라벨링 후 광 산란 모드의 입자 밝기가 증가하여(그림 3 및 4, 파란색 및 녹색 선) 라벨링이 적용되지 않은 대조군에 비해 더 큰 입자 크기로 이동했기 때문에(그림 3 및 4, 회색 선) 두 경우 모두 라벨링이 매우 효과적이었습니다. 이는 지질 함유 구획에 결합하는 DiO의 강한 친화력 때문일 수 있으며, 염료가 입자 표면에 다량으로 달라붙어 입자 주변에 ‘염료 코로나’를 생성하기 때문입니다.

그림 3: DiO로 표지된 렌티바이러스의 크기 분포 및 상관관계 NTA 이미지

그림 4: DiO로 라벨링된 MVA의 NTA 이미지의 크기 분포 및 상관 관계

렌티바이러스 샘플의 경우, 전체 입자 크기 범위와 농도에서 형광이 관찰되었습니다(그림 3). 그러나 이 라벨링 방법은 렌티바이러스를 세포외 소포체와 같은 다른 입자와 구별할 수 없습니다. MVA의 경우 형광 효율이 렌티바이러스보다 낮았으며, 표지되지 않은 입자가 눈에 띄게 많았습니다(그림 4). MVA는 정제가 덜 된 샘플이기 때문에 많은 성분에 지질막이 없어 염료가 부착되지 않습니다. 

요약 

DiO를 사용한 멤브레인 라벨링은 렌티바이러스와 MVA 벡터 제형을 모두 염색하는 데 매우 쉽고 효과적입니다. 멤브레인 라벨링은 특이적이지 않으며 바이러스 벡터를 샘플의 지질 성분/불순물과 구별할 수 없다는 점에 주목할 가치가 있습니다. 

추가 참고 자료

이 응용 노트는 5개 파트로 구성된 시리즈의 일부입니다. 이 주제에 대해 더 깊이 이해하고 싶다면 나머지 시리즈를 살펴보십시오.

• NanoSight Pro를 사용한 빠른 바이러스 벡터 순도 평가 
• NanoSight Pro의 바이러스 벡터 안정성 및 저장 평가
• NanoSight F-NTA로 VSV-G 양성 렌티바이러스 식별

특징 및 관련 제품

*제형 완충액과 함께 Lentivirus 및 MVA 샘플은 Malvern Panalytical의 공동 연구자 중 한 명에 의해 친절하게 제공되었습니다.