La cinética de unión describe la interacción de unión dinámica entre dos moléculas, normalmente expresada como ka (tasa de asociación), kd (tasa de disociación) y KD (constante de disociación de equilibrio, también conocida como “afinidad”). ka (también denominada kon) describe la velocidad a la que las moléculas estudiadas forman un complejo. kd (también llamada koff) describe a qué velocidad decae este complejo. La KD se calcula como kd/ka y determina la concentración de analito a la que la mitad de los ligandos están ocupados por el analito en equilibrio.
Las medidas precisas y eficientes de las interacciones intermoleculares y los eventos de unión es un elemento esencial para todo tipo de investigación básica y un componente indispensable de los programas de descubrimiento de fármacos.
El WAVEsystem, una tecnología Creoptix, ofrece cinética de alto rendimiento, automatizada, sin obstrucciones y sin etiquetas. Obtenga datos cinéticos y de afinidad superiores, incluso para las muestras más difíciles.
Ensayos de unión biomolecular
Los ensayos de unión biomolecular se pueden realizar con moléculas marcadas (radiomarcas, marcas fluorescentes, etc.), pero se requiere una marca adecuada y sin interrupciones, y, a menudo, pasos de lavado y purificación elaborados.
En la cuantificación sin marcadores, una de las moléculas que se van a analizar se inmoviliza en una superficie (el ligando) y las otras moléculas libres en solución (el analito).
El sensorgrama (una representación gráfica de la medición en tiempo real) muestra un estudio típico de la unión analito-ligando en tiempo real.
Imagen de la derecha: El sensorgrama típico muestra la línea de base de las fases, la asociación, la disociación y el retorno a la línea de base.
Análisis de cinética de unión
En primer lugar, como se muestra en el sensorgrama, se determina una línea de base. En pocas palabras, este es el índice de refracción solo del ligando. Luego, se añade el analito sin unir en la solución y se mide la asociación (unión) como un cambio en este índice de refracción. Después de la fase de asociación, se elimina la solución con el analito no unido y se mide la disociación. Aunque el nivel de señal en un sensorgrama se correlaciona con el ligando y el analito involucrados y la fuerza de su interacción, es en la curvatura de sus fases de asociación y disociación donde reside la información valiosa. Por ejemplo, el efecto biológico deseado de un fármaco vinculado a su tiempo de residencia (fase de disociación), en lugar de solo a su afinidad.
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Las mediciones con una única inyección de analito a una concentración única (cinética de un solo ciclo) son rápidas, pero no proporcionan estimaciones confiables de todos los parámetros cinéticos. Tradicionalmente, se mide la cinética en un experimento cinético multicíclico; el análisis cinético confiable y detallado requiere datos de, al menos, cuatro a seis concentraciones de analitos, que abarcan un rango de 0,1 a 10 veces el KD esperado. Esto requiere series de dilución y pasos de disociación entre los ciclos. Por lo tanto, la cinética de varios ciclos requiere mucho tiempo y no es adecuada para la detección de miles de compuestos candidatos.
Cinética sin regeneración
La cinética sin regeneración permite un análisis más rápido mediante la omisión de los pasos de regeneración. Sin embargo, solo se puede aplicar el análisis cinético sin regeneración si el analito se disocia lentamente, ya que se basa en ese pequeño analito que se disocia durante los ciclos de concentración creciente del analito. Hemos desarrollado un revolucionario método de detección: Repeated Analyte Pulses of Increasing Duration (Pulsos repetidos de analito de duración creciente), WaveRAPID, que reducirán drásticamente el tiempo de ensayo y el consumo de reactivos, a la vez que mejora la lectura para identificar candidatos en el proceso de descubrimiento de fármacos con mayor confianza.
El waveRAPID utiliza pulsos de analito a una sola concentración, pero cada pulso se aplica durante un mayor tiempo. Descubra cómo nuestros métodos pueden ayudarlo a obtener datos cinéticos de forma más rápida y sencilla: el recién desarrollado método waveRAPID y el software Direct Kinetics, que proporciona una herramienta de evaluación de un clic.
Nuestros instrumentos
WAVEsystem
Instrumentos bioanalíticos de última generación para el descubrimiento de f...
Con la incorporación de WAVEsystem, ahora Malvern Panalytical ofrece un biosensor óptico para estudiar la cinética de unión en tiempo real.
El WAVEsystem se puede utilizar para dar respuestas a una amplia gama de preguntas científicas. Estas incluyen la determinación de si dos moléculas están interactuando y cuál es la afinidad de unión de las moléculas (KD), así como la confirmación de la concentración biológicamente activa de un analito específico en una muestra.
Además, el WAVEsystem puede medir los parámetros de reacción cinética, como la constante de la tasa de asociación (ka) y la constante de la tasa de disociación (kd), mediante la observación de la unión de ligando-analito en tiempo real.
Visite nuestra página sobre la técnica de GCI para conocer por qué el WAVEsystem con su técnica patentada de GCI tiene una resolución superior a la resonancia de plasmones superficiales (SPR, del inglés Surface Plasmon Resonance) tradicional y la interferometría de biocapas (BLI, del inglés Bio-Layer Interferometry).
