In diesem technischen Hinweis zeigen wir, wie das Creoptix WAVE genutzt werden kann, um die Bindungsdynamik von Sybody®-Kandidaten an der Rezeptor-Bindungsdomäne (RBD) von SARS-CoV-2 zu verstehen, die von der Linkster Therapeutics AG und der Universität Zürich bereitgestellt wurden. Mit seiner hohen Empfindlichkeit und robusten Mikrofluidik eignet sich das Creoptix WAVE für Konkurrenz-Assays zur Bestätigung und Anreicherung von ELISA-Daten. Durch die schnelle kinetische Charakterisierung für Inhibitions-Assays mit ACE2, das freundlicherweise von leadXpro zur Verfügung gestellt wurde, beschleunigt das Creoptix WAVE die Entwicklung von Therapeutika gegen SARS-CoV-2.
Im Gegensatz zu herkömmlichen Arzneimittelprodukten mit kleinen Molekülen, die in der Regel als eine einzige chemische Einheit existieren, sind Biologika wie Antikörper, Nanokörper und andere große Moleküle, die in lebenden Systemen hergestellt werden, hochkomplex. Dies macht ihre Charakterisierung schwierig, zumal viele biologische Wirkstoffe in mehreren Varianten vorliegen, deren Art und Verbreitung stark durch den Herstellungsprozess beeinflusst wird. Angesichts der aktuellen Coronavirus-Pandemie könnten synthetische Single-Domain-Antikörper (auch bekannt als Nanokörper oder Sybody) der Schlüssel zur Entwicklung von COVID-19-Präventivbehandlungen sein, da sie sich für die pulmonale Verabreichung in Form von inhalierten Nanokörper-Formulierungen eignen.1
Die Bindungsaffinität ist wohl eine der am häufigsten untersuchten Eigenschaften eines biologischen Wirkstoffs wie z. B. eines Sybody-Moleküls. Wenn sie jedoch nicht zusammen mit anderen Eigenschaften des Arzneimittels bewertet wird, kann die Bindungsaffinität keine ausreichenden Informationen zur Vorhersage der klinischen Wirksamkeit liefern. Zu einer umfassenden Charakterisierung bei der Entwicklung von biologischen Wirkstoffen gehört die Echtzeitanalyse der Bindungskinetik durch genaue Messung der Assoziations- und Dissoziationsraten für die Wechselwirkung zwischen Antikörper und Ziel.
Dank der verstopfungsfreien Mikrofluidik und der im Vergleich zu herkömmlichen Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Technologien überlegenen Empfindlichkeit für eine genauere Messung der Bindungsaffinität und -kinetik können wir hier zeigen, wie das Creoptix WAVE die Entwicklung von Biologika vorantreibt, indem es Einblicke in die Bindungsaffinität und -selektivität von Sybody-Kandidaten an den Bereich der rezeptorbindenden Domäne (RBD) des SARS-CoV-2-Spike-Proteins liefert.
Biotinyliertes RBD-vYFP wurde auf einem Streptavidin PCP-STA WAVEchip (quasi-planare Polycarboxylat-Oberfläche, Creoptix AG) mit einer Dichte von 1000 pg/mm2 erfasst. Anschließend wurde ACE2 mit steigenden Konzentrationen von 6,25 nM bis 400 nM (zweifache serielle Verdünnung, 7 Konzentrationen) in TBS-Puffer mit 0,05 % Tween-20 (TBST) injiziert. ACE2 wurde 360 Sekunden lang mit einer Durchflussrate von 15 μl/min pro Kanal injiziert. Die Dissoziation wurde auf 1200 s eingestellt, um die Rückkehr zur Grundlinie zu ermöglichen. Die Sensorgramme wurden bei 25 °C aufgezeichnet und die Daten auf dem WAVEcontrol analysiert. Die Daten wurden doppelt referenziert, indem die Signale von Leerinjektionen und vom Referenzkanal subtrahiert wurden. Für die Datenanpassung wurde ein Langmuir 1:1-Modell verwendet (siehe Abbildung 1).
Der ausgewählte Sybody (500 nM in TBST) allein, ACE2 (250 nM in TBST) allein oder eine Mischung aus Sybody (500 nM) und ACE2 (250 nM) wurden 300 Sekunden lang injiziert. Die Dissoziation wurde jedes Mal auf 1200 s eingestellt, um die Rückkehr zur Grundlinie zu ermöglichen. Die Sensorgramme wurden bei 25 °C aufgezeichnet und die Daten mit dem WAVEcontrol nach Doppelreferenzierung überlagert, indem die Signale von Leerinjektionen und vom Referenzkanal subtrahiert wurden.
![[Abbildung 1 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg] Abbildung 1 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg](https://p3.aprimocdn.net/malvernpanalytical/fcc9611c-516f-4b31-ae6c-ae4000a09d7a/Figure%201%20TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD_Original%20file.jpg)
Abbildung 1: Bindungskinetik von gereinigtem ACE2 an biotinylierte Spike RBD
Unsere Zusammenarbeit begann mit dem Erhalt von 57 gut geeigneten und unverwechselbaren Sybody-Kandidaten, die von Linkster Therapeutics AG und Prof. Markus Seeger (Institut für Medizinische Mikrobiologie; Universität Zürich) unter Verwendung der Sybody-Plattform entwickelt wurden.2 Alle Sybody-Kandidaten wurden daher einem Off-Raten-Screening auf dem Creoptix WAVE unterzogen, bei dem sechs starke Bindemittel für Spike RBD identifiziert wurden. In Übereinstimmung mit den ELISA-Daten, die allerdings On- und Off-Raten für weitere kinetische Details liefern, wurden anschließend Bindungskonstanten bestimmt, die Affinitäten im Bereich von 20 bis 180 nM ergaben.3 Angesichts ihrer engen Bindungseigenschaften mit Affinitäten im gleichen Bereich wie die der ACE2/Spike-Wechselwirkung entschieden wir uns dafür, sechs Sybody-Kandidaten weiter zu charakterisieren und ihre Fähigkeit zu untersuchen, um die ACE2-Bindung an Spike RBD zu konkurrieren.
Sybody-Kandidaten konkurrieren um ACE2-Bindung an Spike RBD. Da die Virulenz von SARS-CoV-2 die Bindung des viralen Spike RBD an das humane ACE2 erfordert, haben wir die Fähigkeit ausgewählter Sybody-Kandidaten untersucht, die ACE2-Bindung an Spike RBD nach ihrer gemeinsamen Injektion zu hemmen.
Ein Stretavidin PCP-STA WAVEchip wurde verwendet, um die biotinylierte Spike RBD zu erfassen, und Sybody-Kandidaten und gereinigtes ACE2 wurden entweder allein oder in Kombination mit den angegebenen Konzentrationen injiziert. Wie in Abbildung 2E gezeigt, wurde die Bindung von ACE2 an Spike RBD in Gegenwart von Sybody 16 fast vollständig aufgehoben, was auf eine außergewöhnlich hohe Hemmung der ACE2-Spike-Wechselwirkung hinweist. Diese Hemmung ist in Gegenwart von Sybody 3 bzw. Sybody 42 (Abbildungen 2C bzw. 2D) teilweise und mit Sybody 67 (Abbildung 2B) vollständig ineffizient. Diese GCI-Daten stimmen mit den zuvor berichteten ELISA-Ergebnissen (Abbildung 2E) überein und haben den Vorteil, dass sie eine schnellere Charakterisierung dieses Inhibitions-Assays ermöglichen. Die mit diesen Arten von analytischen Assays gesammelten Nachweise unterstützen die Beobachtung, dass die Sybody-Kandidaten 3, 16 und 42 eine Oberflächenregion an der Spike RBD erkennen, die sich mit der ACE2-Bindungsstelle überschneidet.
![[Abbildung 2 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg] Abbildung 2 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg](https://p3.aprimocdn.net/malvernpanalytical/ed6bb461-28e0-4b0d-b6b4-ae4000a09ea1/Figure%202%20TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD_Original%20file.jpg)
Abbildung 2: Sybody-Kandidaten konkurrieren um ACE2-Bindung an Spike RBD
Zusammengefasst: Wir zeigen hier, wie das Creoptix WAVE die schnelle Charakterisierung von Kandidaten aus den zuvor veröffentlichten Sybody-Bibliotheken ermöglicht hat, und bestätigen Erkenntnisse, wie diese Sybody-Kandidaten die ACE2-Spike-Wechselwirkung hemmen.3 Durch die schnelle und orthogonale Validierung von ELISA-Daten ist das Creoptix WAVE ideal geeignet, um im Wettlauf um das Verständnis der COVID-19-Pandemie voranzukommen, indem es die Entwicklung von Therapeutika gegen SARS-CoV-2 beschleunigt.
Verstehen Sie die Bindungsdynamik für die Entwicklung von Therapeutika, und generieren Sie neue Daten, um Ergebnisse und Veröffentlichungen mit dem Creoptix WAVE zu verbessern:
Ideal für:
Mit Venus YFP (RBD-vYFP) fusioniertes, biotinyliertes SARS-CoV-2 Spike-RBD-Protein und die Sybody-Kandidaten wurden freundlicherweise von Professor Markus Seeger (IMM, Zürich) und der Linkster Therapeutics AG zur Verfügung gestellt. Die gereinigte, Histidin-markierte Ektodomäne des humanen Angiotensin-konvertierenden Enzyms 2 (ACE2) wurde freundlicherweise von Dr. Matthieu Botte (leadXpro) zur Verfügung gestellt.
