このテクニカルノート内の実験は、顧客であるIdorsia Pharmaceuticals LtdのHTS創薬グループが実施したもので、多数の薬物ヒット化合物の反応速度特性評価を整理することで、waveRAPIDの能力を示し、従来のSPRと同等の結果と高い再現性を示しています。各サンプルのパルス注入を単一の濃度で行うことで接触時間が短縮され、標的タンパク質が保持されるため、長時間の実行が可能になり、数百の相互作用を数週間ではなく数日で測定できます。
数千の化合物の創薬高スループットスクリーニングでは、大量のヒットが発生し、薬剤標的との潜在的な相互作用が示される可能性があります。結合親和性は、多くの高スループットアッセイの定常状態解析から取得できます。さらに開発が可能なヒットを選択するには、結合反応速度の完全な特性評価が必要です。これにより、特に望ましい反応速度の結合率で目的標的に到達する化合物が同定されます。実際には、これは多数のスクリーニングヒット化合物に対して広範な動態研究を実施する必要があることを意味します。これまでは、極めて多くの時間と材料を消費する作業でした。数百のヒット化合物から適切な希釈系列を準備し、各濃度を複製物に注入する必要があります。Creoptixは、このようなプロジェクトをより効率的に行える新しい技術を開発しました。これにより、単一の濃度でサンプルから強力な反応速度特性評価を実行できます。Creoptix WAVEのCreoptix waveRAPIDは、スクリーニング設定における反応速度測定のパラダイム変化を表しています。
現在、当社の顧客であるIdorsia Pharmaceuticals LtdのHTS創薬グループの研究では、多数の薬物ヒット化合物の反応速度特性評価を整理する際に、waveRAPIDが能力を発揮しています。複数の実験において、センサマトリックスに事前に固定された薬剤標的に単一濃度でサンプルをパルス注入することで、最大146個のヒット化合物の結合反応速度がwaveRAPIDによって決定されました。従来のマルチサイクル反応速度測定を使用して、すべての分析化合物が、最新のSPR装置で研究されてきました。
2つの技術から取得したデータを比較すると、計算された解離定数(KD)と少数の外れ値との優れた相関が明らかになりました。この研究結果は、初期創薬の応用において、Creoptix WAVEのwaveRAPID技術を検証し、高スループットのスクリーニング設定で、詳細な動的データの生成を可能にします。各化合物の特性評価の時間がわずか数分に短縮されるため、時間と材料を大幅に節約できます。数百種類の結合反応速度を決定するための大規模な測定が、最新のSPR装置と比較して、数週間ではなく数日で実施できます。
さらに、waveRAPID技術は、アッセイシリーズ全体で複雑な化合物(大きな屈折率の寄与や解離の遅さを示す化合物など)に対しても堅牢なデータを生成しました。このような化合物では、多くの場合、リガンドタンパク質の表面の再生と再固定が必要になります。このため、従来のマルチサイクルアッセイを使用した大規模な測定では、ワークフローが中断されます。Creoptix WAVEに加えて新しいwaveRAPID方法を使用することで、極めて簡単なアッセイ設定が可能になり、サンプルごとに単一の濃度から完全な結合反応速度解析を行うことができます。さらに、統計パラメータの推定値に基づいたCreoptix独自の新しい評価エンジンであるDirect Kineticsは、真の統計誤差計算を含む、自動化された堅牢な分析ワークフローを提供します。waveRAPID技術とDirect Kinetics自動評価エンジンは、現在の初期の創薬における反応速度結合アッセイの実行方法に変革をもたらす強力なパッケージです。
ヒスチジンタグ付き標的タンパク質1およびヒスチジンタグ付き標的タンパク質2は、以前にNi2+イオンが装填された4PCP-NTA WAVEchip上で、4000~5000 pg/mm2の密度で捕捉されました。10 μMのサンプル溶液から、フローセルあたり32.5 μl/分の流量で化合物のパルス波RAPID注入を25秒間行った後、250秒間緩衝液を注入しました。すべての測定を、0.05% Tween-20および5% DMSOの50 mmのリン酸緩衝液で実施しました。データは、参照チャネルの信号とブランク注入を減算して二重参照されています。6つの注入パルスを介した検出領域内の化合物の見かけ濃度は、化合物サンプルと同じ注入パラメータ、および追加の0.5% DMSOを添加したパルス注入緩衝液を使用してキャリブレーションされました。反応速度解析は、1:1結合モデルを使用してDirect Kinetics評価エンジンにより実行されました。
ヒスチジンタグ付き標的タンパク質1およびヒスチジンタグ付き標的タンパク質2は、事前にNi2+イオンで活性化されたNi-NTAチップ上で、4000~5000 pg/mm2の密度で捕捉されました。検体は、緩衝液(0.05% Tween-20および5% DMSOの50 mmリン酸緩衝液)中で連続希釈することにより、目的の濃度に調整されました。センサグラムは、結合時間100秒、解離時間250秒、流量40 μl/分で取得されました。結合反応速度(kon、koff、およびKd)を決定するために、二重参照後に取得したセンサグラムは、1:1結合モデルを使用したBiacore T200評価ソフトウェアによって解析されました。
スクリーニングのような設定で反応速度結合データを迅速に取得する新しいwaveRAPID技術が、この研究の最先端の装置と方法論に対して検証されました。図1が示すように、単一の濃度で各サンプルをパルス注入することで、多数のスクリーニングヒット化合物に対して反応速度結合データを迅速に生成できます。検体の解離を含む、各測定時間は約5分です。waveRAPIDによって生成された一般的な応答プロファイルは、図1、パネルA、Bに示されています(データは赤色で表示されており、反応速度1:1モデルは黒で表示されています)。評価されたパラメータは、パネルCのレートマップ(黒色の円内のアッセイ全体に注入された制御化合物)に表示され、優れた再現性を示しています。典型的なアッセイと2つの標的にある384個のサンプルを比較した、標準的なアッセイ時間とサンプルスループットが表1に示されています。
WAVE | Biacore T200 | Biacore 8K | |
---|---|---|---|
標的数 | 2 | 2 | 2 |
サンプル数 | 384 | 384 | 384 |
アッセイの種類 | waveRAPID | 反応速度 | 反応速度 |
親和性レンジ | nM | nM | nM |
サンプルごとに取得したステップ | 0 | 0 | 0 |
サンプルあたりの試薬ステップ | 0 | 0 | 0 |
実行時間(h) | 58 | 490 | 122 |
サンプル/24時間 | 159 | 19 | 75 |
表1: 典型的なアッセイ実行時間とサンプルスループット: WAVEdeltaのwaveRAPIDと最先端技術(Biacore T200、8k)を比較して、2つのターゲット上の384個のサンプルの全反応速度評価を行いました。
取得した動的データは、結合速度(絶対kaの100%未満、および絶対kdの50%未満)のエラーでフィルタリングされ、標準SPRマルチサイクル測定のデータと比較されました。図2に示されているように、従来のSPRマルチサイクル測定と比較すると、2つのデータセット間の相関関係が極めて良好であることがわかります。
さらにシステムを検査するために、別の測定を連続で実施しました。この測定では、従来のマルチサイクル測定でワークフローの中断や表面の再生を発生させる、より複雑な化合物がアッセイ全体で実行されました。標的タンパク質との検体の接触時間が大幅に短縮されたことが原因であると推定されますが、これらの複雑な分子(高いバルク応答または解離の遅さを示す)により、WAVEの全体的なワークフローが中断することはなく、断続的な表面再生が不要になることもありませんでした。図3に示すように、ほとんどすべての対象化合物の反応速度結合パラメータは、低誤差で確実に評価することができ、陽性コントロールは引き続き高い再現性を示しています。
高感度、超高速相互作用を解決する機能、およびwaveRAPIDアッセイ技術を備えたWAVEsystemは、従来のマルチサイクル反応アッセイと比較して、極めて短い時間で大量の薬物ヒット化合物の反応速度特性評価を実行できます。1回の注入で1つのウェルから反応速度を得ることにより、試薬とサンプルの消費量が削減され、初期の創薬に大きなメリットがもたらされます。さらに、waveRAPIDには次のようなメリットがあります。
以下の用途に最適です。
すべての実験を実施し、本ドキュメントに貢献したGeoffroy Bourquin、Laksmei Goglia、Solange Meyer、Oliver Peterの各氏に謝意を表します。