DSCを用いたバイオ医薬品開発向上のための抗体Fab領域の安定性の調査

αTT Fabライブラリの変異体および熱安定性スクリーニング

45種類の変異体PCRをそれぞれ形質転換し、4500近くのコロニーをピックアップ後、96-wellプレートで培養しました。 Fabを含む上清は、70°C、72°C、74°Cの3つの温度で加熱しました（2）。 熱安定性が向上した変異体は、性質を確認するため熱安定性スクリーニングを繰り返し実施しました。

安定化変異体のリストは(2)に示されています。 ライブラリ内のおよそ1%の変異体で熱安定性の向上が見られました。 「ヒット」したうちの14個がV_Hドメインに変異があり、残りの4個はV_Lドメインにありました。 このことは、天然のFabの安定性はV_Hの局所的な安定性によって制限されることを示唆しています。 驚くべきことに、2000程度の定常領域に変異が入ったライブラリーでは、Fab全体を安定化させる変異体は見つかりませんでした。 我々の推測では、定常領域内の安定化変異は実際に起きてはいるものの、V_Hドメインの局所的な安定性がFabのアンフォールドの温度を抑制したため、安定化が起きているようには見えなかった、ということです。（下記のDSC実験を参照）。

C_L/C_H1ドメイン内で安定化変異体を見つけられなかったことのもう1つの説明として、高温条件下におけるアンフォールディングの時間として、10分は不十分であったため、定常領域を完全にアンフォールドできなかったのではないかということです。 Röthlisbergerと共同研究者は、C_L/C_H1ヘテロダイマーのアンフォールディングが極端に遅く（6）、4つのすべてのFabドメインの安定性がこの動的安定化の恩恵を受けたことを発見しました。 そのため、比較的短時間の熱負荷では定常領域がアンフォールドしなかったものと考えられます。

安定V_H変異体の多くが全体的なコンセンサスに一致しませんでしたが、その大半が他のV_Hのgermlineのサブクラスの少なくとも1つ以上でコンセンサスが一致しました（2）。 たとえば、αTT V_H内の72番目のアミノ酸は、Asnへの変異によって最適化されました。 すべてのgermlineのV_Hサブファミリーのコンセンサスの残基は等配電子アミノ酸のアスパラギン酸です。 72番目の残基の配列を確認したところ、意外なことにアスパラギン酸に置き換わっていないことがわかりました。 また、89番目のバリンがほとんどのヒトV_Hサブファミリーで保存されていても、Valへの変異導入はFab安定性を向上させませんでした。 等配電子V_H2の共通アミノ酸残基であるスレオニンは、スクリーニングで、高い安定性を保っていました（ΔT_m > 2°C）。 同様にベータ分岐したイソロイシンは、スクリーニングで見つかった中で最も安定している変異体の1つであり、ヒトV_H配列のこの位置ではごくまれにしか見つからないものですが、ほかのどのV_Hサブクラスの共通残基でもありません。

4個の安定化変異体がαTT V_Lドメイン内で見つかりました。 V_K4の残基、トリプトファン50をアラニン（V_K1の共通残基）またはヒスチジンの変異を入れると、きわめて高いレベルで安定化されました。 ヒスチジンはヒトκ可変領域の50番目の残基でごくにまれにしか見つかりませんが、ヒトλ可変領域ではしばしば見つかります。 この残基は、V_H/V_Lドメイン付近にあります。 我々はFab安定化の寄与はV_Hドメインの潜在的な強化に関連しているのではないか、という仮説を立てました。なぜなら、特にV_HドメインがαTT Fabの安定性に制限を与えているように見えるためです（2）。 しかしながら、単離されたV_Lドメインは、それとは逆の現象を示しています（データ未記載）。 この位置におけるチロシンからヒスチジンへの変異は、ジスルフィドがないscFvの見掛け上の安定性と発現を改善することが報告されています（7）。 したがって、V_Lフレームワーク2でC末端末にある、50番目残基に大きな芳香族グループが現れることは
あらゆるケースでFv安定性に不利となりました。

αTT Fabの安定化変異の組み合わせ結果

初期スクリーニングで同定された、3～11の安定化変異を含む12個のコンストラクトが準備されました（表２）。 さまざまな変異のコンビネーションが、Fabの安定化をもたらすそれぞれの変異体の明らかな寄与を決定することにより、合理的に解明されました。

興味深いことに、αTT Fabへの複数の安定化変異を導入することで、形質転換並びに発現実験でFabの発現量が増加しました。 最もよかったコンストラクトは一貫して、野生型の3倍以上に発現量が増加しました。 各Fabの安定性は、DSC（図3）および円偏光二色性（CD）（データ未記載）で評価しました。 DSCとCDスキャンは一般的に非可逆的であり、測定後に溶液は沈殿を生じました。 Fabが凝集したため、見えているT_m値を用いてFabの安定性をランクづけしました。

4個全てのドメインが分子内、および分子間でジスルフィド結合で完全につながっている場合、それらのドメインの共役したアンフォールディングは、Fabの一般的な特徴ではないものの、共通していました（1,3,6,8,9）。 個別のドメインの内在的な安定性が大幅に異なることによる、マルチドメインタンパク質のアンフォールディング反応の脱共役は珍しいことではなく、ドメイン相互の全般的な親和性とドメイン間の相互作用表面の総和で決まります（10、11)。 Fabの一部が欠損している場合、残りのドメインのアンフォールディングは共役されない場合があります。 RoweおよびTanfordの発表によれば、V_LとC_LがH鎖に付いておらず、分離された
ドメインとしてアンフォールドしている場合、κL鎖内のV_LとC_Lが脱共役して変性しているように見えます（12）。 また、協同性ではH鎖との別のコンタクトが必要となります。 Röthlisbergerと共同研究者は最近、網羅的かつ簡潔な実験を行った結果について報告しています。そこでは、異なる安定性をもつ可変領域が、互いに独立してどのようにアンフォールドできるかを示しています。同時に、同じような高い安定性を持つ可変領域がFabの4個すべてのドメインのアンフォールディング転移を一体化することができます（6）。 ここで記載している、最も安定化したFabコンストラクト（T_m = 92°C）は、同時に可変領域の熱アンフォールディング反応を脱共役させるぎりぎりのポイントにあるように見えます。

各変異のそれぞれの安定性への寄与をデコンボリューションするために、12個全てのFab変異体のTm値を使用しました。 Fabの1次配列でも、3次構造であっても、これらの残基のいくつかは互いに近接していますが、全ての変異はFabの安定性の付加に寄与していると思われます。 今回の解析は、4つの変異がFab安定化の最大86%を占めていることを示していました。 V_Hドメイン内のG24A、T72N、F89Iの変異が、FabコンストラクトのT_mをそれぞれ3.0°C、2.8°C、2.8°C上げました。 V_Lドメイン内のW50Hの変異は、Fabの熱安定性を3.5°C上げました。

Fabの熱安定性とE.coliで発現した機能タンパク質の分画との相関

フレームワークの変異に続いて考慮すべき重要な点は、これがαTT Fabの抗原結合部位の機能に与えるかもしれない潜在的な影響でした。 熱安定化変異は、C_LドメインとC_H1のC末端にあるHisタグを検出する定量的ELISAを用いたオリジナルスクリーンから得られました。 多くの場合、Fvドメインのダイナミクスが抗原結合に大きな影響を与える可能性があるといわれています。 我々が懸念していたのは、Fvフレームワークドメインに導入された安定化変異が、抗原のドッキングのダイナミックバランスを崩しかねないことでした。

熱安定化変異は、E. coliで発現した分子の機能を下げず、実際には機能的ELISAのaTTFabの親和性が向上しました（表2）。 別々に調製した２つの野生型Fabは機能的ELISAで抗原に対し同じように滴定されませんでした。これは細胞培養中の小さなばらつきが、機能をもつFab発現の量をわずかに抑制する可能性があることを示唆しています。 いずれの野生型の調製量において、機能をもつタンパク質の収量は、ほとんどの安定化aTTFabコンストラクトよりも少なかったです。 各Fab変異体の機能をもつ発現量は、T_mで示された安定性と直接相関しているように見えます（図4）。 変異が予測される結合ループから離れていると、これらの残基が抗原との相互作用を直接向上させる可能性は低いと考えられます。

野生型aTTFabの挙動から、E. coliから分泌されたFabフラグメントは、機能を持っていないか、またはミスフォールドしていると考えています。 この解釈は、E.coliで分泌され、単離されたV_Lドメインが、BL21trxB(DE3)の酸化細胞質環境下で発現したVLと全く異なったコンフォメーションをしていた事実と相関しています（結果は未記載）。 _{このことは、Fab生成物のバッチ間で機能的なばらつきが見られたことの説明にもなります。}

図4 各Fabにおける、T_m値と機能的ELISAのシグモイド曲線の中点濃度の比較プロット Oxford University Pressの許可を得て（2）から転載。

概要

18個のヒトまたはヒト化抗体の熱によるアンフォールディングプロファイルをDSCで測定したところ、広範囲に渡るFabの安定性が明らかになりました。 コンセンサスデザインを使用し、特に不安定なFabの安定性を図るために、網羅的に変異体を調製しました。 熱負荷アッセイを用いたFabライブラリーのスクリーニングにより、Fabの11か所に19個の安定化変異が見つかりました。 安定化変異の組み合わせにより、熱安定性が最高92°Cまで向上し、バクテリアの発現が増え、ミスフォールディングや、機能を持たない試料が大幅に減りました。 DSCは、抗体の安定性に寄与するファクターを迅速に判別できます。また、DSCはバイオ医薬品開発全般に適用可能な、価値のある安定情報性を呈示する測定技術です。

謝辞

このアプリケーションノートのはStephen J Demarest、Ellen Garber、Gang Chen、Bruce E.Kimmel、David Gustafson、Jane Wu、Jared Salbato、John Poland、Marikka Elia、Xuqiu Tan、Ken Wong、Jay M.Short、Geneviève Hansen（Biogen Idec、カリフォルニア州サンディエゴ）によって執筆されました。 　 　

参考文献

1. Garber, E., and Demarest , S.J. A broad range of Fab stabilities within a host of therapeutic IgGs. Biochem. Biophys. Res. Commun. 355, 751-757 (2007).
2. Demarest , S. J. et al. Engineering stability into Escherichia coli secreted Fabs leads to increased functional expression. Protein Engng. Des. Select. 19, 325-336 (2006).
3. Vermeer, A. W. P. and Norde, W. The thermal stability of immunoglobulin: unfolding and aggregation of a multi-domain protein. Biophys . J. 78, 394-404 (2000).
4. Sánchez-Ruiz, J. et al. Differential scanning calorimetry of the irreversible thermal denaturation of thermolysin. Biochemistry 27, 1648-1652 (1988).
5. Larrick, J. W. et al. Characterization of human hybridomas secreting antibody to tetanus toxoid. Proc . Natl. Acad. Sci. US A 80, 6376–6380 (1983).
6. Röthlisberger, D. et al. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the singlechain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. J. Mol. Biol. 347, 773-789 (2005).
7. Proba, K. et al. Antibody scFv fragments without disulfide bonds made by molecular evolution. J. Mol. Biol. 275, 245-253 (1998).
8. Kelley, R. F. et al. Antigen binding thermodynamics and antiproliferative effects of chimeric and humanized anti-p185HER2 antibody Fab fragments. Biochemistry 31, 5434-5441 (1992).
9. Shimba, N. et al. Comparative thermodynamic analyses of the Fv, Fab*, and Fab fragments of the anti-dansyl mouse monoclonal antibody. FEBS Lett. 360, 247-250 (1995).
10. Ewert , S. et al. Biophysical properties of human antibody domains. J. Mol. Biol. 325, 531-553 (2003).
11. Varea, J. et al. Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci. J. Biol. Chem. 279, 43679-43707 (2004).
12. Rowe, E. S. and Tanford, C. Equilibrium and kinetics of the denaturation of a homogeneous human immunoglobulin light chain. Biochemistry 12, 4822-4827 (1973).
13. Saphire, E. O. et al. Crystal structure of a neutralizing human IgG against HIV-1: template for vaccine design. Science 293, 1155–1159 (2001).