保存条件が免疫グロブリンに及ぼす影響

はじめに

抗体は、免疫システムの重要な一部として機能する特殊なタンパク質です。抗体は免疫グロブリンとして知られるタンパク質の一種であり、通常150 kDa付近の分子量を持ちます。ここでは ゼータサイザーの光散乱技術を用いて、これらのタンパク質のサイズと品質に対するさまざまな保存条件の影響を調査しました。動的光散乱（DLS）は、散乱光の時間依存性の揺らぎを測定して拡散速度を測定し、これを使用してストークス-アインシュタインの関係を使用して溶液中の分子のサイズを計算します。静的光散乱（SLS）は、時間平均強度を測定して分子の分子量（MW）を求めます。

実験

調製したばかりの抗体サンプルを3つに分け、異なる環境で保存しました：

• 4℃で35日間
• 25℃で31日間、その後4℃
• 凍結融解サイクル5回、その後4℃

すべてのサンプルは、pH=6.8の炭酸水素アンモニウム緩衝液中で、0.8 mg/mLの濃度で調製されました。調製には濾過工程はなし。サンプルの流体力学的サイズは、12μLキュベット（ZEN2112）で測定しました。

各サンプルの希釈系列を同じバッファーで調製し、静的光散乱法による分子量の測定と比較を行いました。実験はすべて25℃で行いました。

結果

流体力学的サイズ

抗体の場合、予想されるサイズは直径10 nm付近でした。これらの抗体の測定では、処理の異なるサンプル間で有意差が見られました。すべてのサンプルが予想される範囲にピークを示したが、メインピークの割合は条件によって異なりました（図1）。試料を理想的でない条件で保存した場合、タンパク質ピークから低い散乱シグナルが得られました。凍結融解サイクルによって、モノマーとして存在するタンパク質の量が減少したようです。さらに、室温で長期間保管したり、凍結融解を繰り返したりすると、より大きな凝集体が現れました。キュムラントフィットによるz平均サイズ（サンプルの全体平均）は、多分散性指数（PdI）パラメーター（ISO22412）を通して、このサンプルの「品質」を識別する簡単な方法を提供します。表1に3つのサンプルのデータを示します。

図1: 異なる条件下で保存した抗体サンプルの粒度分布（％散乱強度）： 4℃（緑）、25℃（青）、5回の凍結／融解後（赤）

多分散性指数(PdI)は明らかに、試料が不適切な保管によって害を受けたかどうかを示す強い指標となります。

表1：粒径と多分散性指数は保存条件に影響される

図1の粒子径分布は、図2に示すように体積分布として表示することもできます。凝集による寄与は標準的な表示では見えないが、繰り返し凍結したサンプルという最悪のケースでも、主タンパク質ピークの体積寄与率は99.6%です。光散乱は散乱物質のサイズに非常に敏感であるため、タンパク質溶液中の大きな成分の存在を見つけるのに理想的な手法です。

図2：異なる条件で保存した抗体サンプルのサイズ分布（体積％）： 4℃（緑）、25℃（青）、5回の凍結／解凍後（赤）

分子量

凝集の存在は静的光散乱で確認されました。このサンプルの予想分子量は約150kDaです。表2に示すように、4℃保存サンプルの結果は予測値と一致しています。9∙10^-4 mL mol / g²という小さな正の第2ビリアル係数も得られ、これは溶液が安定であることを示しています。室温で保存した試料は、より高い分子量を示しました。これは、このサンプルの一部が凝集している可能性を示しています。繰り返し凍結したサンプルは、DLSで顕著な凝集の存在を示したが、測定された分子量はモノマーのそれに非常に近い結果となりました。ゼータサイザーの高度なダスト除去アルゴリズムにより、大きな凝集体の寄与を分離することができ、依然として優れた結果を得ることができました。

表2：異なる条件で保存した抗体試料の分子量

まとめ

ゼータサイザーは、サンプルの安定性と品質の評価に使用できます。動的光散乱は、溶液中のタンパク質の状態を確立するための高速で使いやすい技術で、保存の影響を比較する場合、最も重要なサンプル品質パラメータは多分散性指数（PDI）です。