Nesta nota técnica, mostramos como o WAVE da Creoptix pode ser usado para entender a dinâmica de ligação dos candidatos Sybody® ao domínio de ligação do receptor (RBD) do SARS-CoV-2, ambos fornecidos pela Linkster Therapeutics AG e pela Universidade de Zurique. Com alta sensibilidade e microfluídicos robustos, o WAVE da Creoptix é adequado para ensaios de competição, confirmando e enriquecendo os dados ELISA. Ao fornecer uma caracterização cinética rápida para ensaios de inibição, com a ACE2 fornecida pela leadXpro, o WAVE está acelerando o desenvolvimento da terapêutica contra o SARS-CoV-2.
Diferentemente dos produtos tradicionais de medicamentos de pequenas moléculas, que normalmente existem como uma única entidade química, os biológicos, como anticorpos, nanocorpos e outras grandes moléculas fabricadas em sistemas vivos, são altamente complexos. Isso torna sua caracterização desafiadora, especialmente porque muitos medicamentos biológicos existem como variantes múltiplas, cuja natureza e abundância são fortemente influenciadas pelo processo de fabricação. Em meio à atual pandemia do coronavírus, os anticorpos sintéticos de domínio único (também conhecidos como nanocorpos ou Sybody) podem ser fundamentais para o desenvolvimento de tratamentos preventivos contra COVID-19, dada sua adequação à administração pulmonar na forma de formulações inaladas de nanocorpos.1
A afinidade de ligação é, sem dúvida, uma das propriedades mais estudadas de um biológico, como a molécula Sybody. Mas, a menos que seja avaliada juntamente com outras qualidades do medicamento, a afinidade de ligação não pode fornecer informações suficientes para prever a eficácia clínica. A caracterização abrangente do desenvolvimento de medicamentos biológicos também deve incluir a análise em tempo real da cinética de ligação através da medição precisa das taxas de associação e de dissociação para a interação anticorpo-alvo.
Com microfluídicos sem entupimentos e sensibilidade superior às tecnologias convencionais de Ressonância plasmônica de superfície (SPR) para uma medição mais precisa da afinidade de ligação e cinética de ligação, aqui mostramos como o WAVE da Creoptix está impulsionando o desenvolvimento de biológicos, fornecendo insights sobre afinidades de ligação e seletividade de candidatos Sybody à região de domínio de ligação de receptor (RBD) da proteína SARS-CoV-2 Spike.
O RBD-vYFP biotinilado foi capturado em um WAVEchip PCP-STA de estreptavidina (superfície quase plana de policarboxilato; Creoptix AG) para uma densidade de 1000 pg/mm2. Em seguida, a ACE2 foi injetada em concentrações crescentes que variaram de 6,25 nM a 400 nM (diluição serial dupla, 7 concentrações) no tampão TBS suplementado com Tween-20 a 0,05% (TBST). A ACE2 foi injetada por 360 s a uma vazão de 15 μl/min por canal e a dissociação foi definida para 1200 s para permitir o retorno à linha de base. Os sensorgramas foram registrados a 25 °C e os dados analisados no WAVEcontrol. Os dados foram referenciados duas vezes subtraindo os sinais de injeções em branco e do canal de referência. Foi utilizado o modelo Langmuir 1:1 para ajuste de dados (Figura 1).
O Sybody selecionado (500 nM em TBST) isoladamente, a ACE2 (250 nM em TBST) isoladamente ou uma mistura de Sybody (500 nM) e a ACE2 (250 nM) foi injetada por 300 s e a dissociação foi estabelecida a cada vez para 1200 s para garantir o retorno à linha de base. Os sensorgramas foram registrados a 25 °C e os dados sobrepostos usando o WAVEcontrol após referência dupla subtraindo os sinais de injeções em branco e do canal de referência.
![[Figura 1 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg] Figura 1 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg](https://dam.malvernpanalytical.com/fcc9611c-516f-4b31-ae6c-ae4000a09d7a/Figure%201%20TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD_Original%20file.jpg)
Figura 1: cinética de ligação da ACE2 purificada na spike RBD biotinilada
Nossa colaboração começou recebendo 57 candidatos exclusivos e bem comportados da Sybody, criados pela Linkster Therapeutics AG e pelo Prof. Markus Seeger (Instituto de Microbiologia Médica; Universidade de Zurique) usando a plataforma Sybody.2 Todos os candidatos da Sybody foram, portanto, submetidos a uma triagem de taxa de dissociação no WAVE da Creoptix, que identificou seis fortes ligantes à Spike RBD. De acordo com os dados ELISA, mas fornecendo taxas de associação e de dissociação para mais detalhes cinéticos, as constantes de ligação foram determinadas, revelando afinidades dentro da faixa de 20 a 180 nM.3 Considerando suas propriedades de ligação rígida, com afinidades na mesma faixa da interação ACE2/Spike, decidimos caracterizar mais seis candidatos Sybody e investigar sua capacidade de competir pela ligação ACE2 à Spike RBD.
Os candidatos Sybody competem pela ligação da ACE2 à Spike RBD. Uma vez que a virulência do SARS-CoV-2 requer a ligação do Spike RBD viral à ACE2 humana, avaliamos a capacidade dos candidatos selecionados da Sybody de inibir a ligação da ACE2 à Spike RBD, mediante sua coinjeção.
Utilizou-se WAVEchip PCP-STA de estreptavidina para capturar a Spike RBD biotinilada, e os candidatos Sybody e a ACE2 purificada foram injetados isoladamente ou em combinação nas concentrações indicadas. Como mostra a Figura 2E, a ligação da ACE2 à Spike RBD foi quase completamente abolida na presença do Sybody 16, demonstrando um nível de inibição excepcionalmente alto da interação ACE2-Spike. Essa inibição é parcial na presença de Sybody 3 ou Sybody 42 (Figuras 2C e 2D, respectivamente), e completamente ineficiente com Sybody 67 (Figura 2B). Esses dados da GCI estão de acordo com os resultados ELISA previamente relatados (Figura 2E), com a vantagem de permitir uma caracterização mais rápida desse ensaio de inibição. A evidência obtida com esses tipos de ensaios analíticos apoia a observação de que os candidatos Sybody 3; 16 e 42 reconhecem uma região superficial na Spike RBD que se sobrepõe ao local de ligação da ACE2.
![[Figura 2 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg] Figura 2 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg](https://dam.malvernpanalytical.com/ed6bb461-28e0-4b0d-b6b4-ae4000a09ea1/Figure%202%20TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD_Original%20file.jpg)
Figura 2: Os candidatos Sybody competem pela ligação da ACE2 à Spike RBD
Em resumo, mostramos aqui como o WAVE da Creoptix permitiu a rápida caracterização de candidatos provenientes das bibliotecas da Sybody previamente publicadas, além de confirmar percepções sobre como esses candidatos Sybody inibem a interação ACE2-Spike.3 Fornecendo validação rápida e ortogonal dos dados ELISA, o WAVE da Creoptix é ideal para avançar na corrida para entender a pandemia de COVID-19, acelerando o desenvolvimento da terapêutica contra SARS-CoV-2.
Compreenda a dinâmica de ligação para o desenvolvimento terapêutico e gere novos dados para fortalecer resultados e publicações com o WAVE da Creoptix:
Excelente para:
A proteína Spike RBD biotinilada do SARS-CoV-2 fundida com Venus YFP (RBD-vYFP) e os candidatos Sybody foram gentilmente fornecidos pelo Professor Markus Seeger (IMM, Zurique) e pela Linkster Therapeutics AG. O ectodomínio purificado e com etiqueta de poli-histidina da enzima conversora da angiotensina humana 2 (ACE2) foi generosamente proporcionado pelo Dr. Matthieu Botte (leadXpro).
