蛋白质稳定性测量平台的采购指南

概述

大多数生物治疗药物为蛋白质或蛋白质衍生物，且当前上市或开发中的最大一类生物技术药物为单克隆抗体 (mAb)。 抗体的特异性结合特性为生物制药行业提供了机遇，可用于调节生物技术药物相关靶标分子的活性以控制或预防疾病。

传统小分子制药和生物技术药物之间的关键区别在于后者需要以液体形式处理和传递。 蛋白质在溶液中非常不稳定，因此需要开发使这些生物治疗分子可在溶液中长时间制造和储存而不降解的方法。 这就是蛋白质稳定性试验在生物治疗药物开发和制造中极其重要的原因。

很明显，需要实时稳定性试验来评价溶液中蛋白质的寿命或有效期。 但是，这些通常非常耗时，因此建立了更快的预测方法来加速学习过程，从中开发出稳定生物药物制剂和流程条件。  

这些预测方法中最常用的是热去折叠方法，其可监测蛋白质在温度作用下的物理特性。  使用这些数据，蛋白质发生构象改变的温度可确定并用于比较研究。 我们推测需要更高温度来诱导构象改变的分子拥有更长的有效期或更稳定。 然而，存在某些重要例外，将在本文档的后续部分对其进行解释。

可获得相同缓冲液中不同药物候选药物的去折叠或热稳定性曲线，以在给定的一系列条件下比较潜在生物治疗药物的内在稳定性。 该应用称为“候选药物选择”。

可为一系列缓冲液和共溶质中的任何候选药物生成热稳定性曲线，以帮助确定稳定/不稳定条件。  典型制剂助剂或辅料包括氨基酸、糖类、多元醇、盐类和洗涤剂，必须小心确保这些物质不干扰试验。 这些测试类型通常由预/制剂和流程开发团队实施。 后者的目标是通过确定色谱层析的稳定上样缓冲液和洗脱缓冲或优化病毒灭活步骤，以确定将最大化生物治疗药物产量的纯化策略。

这些分析技术中更可定量的技术（如差示扫描量热法 (DSC)），也用于生物相似性和可比性研究。

正如前面所述，我们推测需要更高温度来诱导构象改变的分子将拥有更长的有效期。 但是，如果选择用于监测这些改变的技术对特定构象事件或化学灭活过程“视而不见”，该“经验法则”可能有误导性。  这是为什么购买您的下一个稳定性试验平台时需要谨慎考虑的原因之一。

现在市场上有很多测量蛋白质稳定性的技术。 许多制造商通过与从差示扫描量热法 (DSC) 获得的结果相比，论证了这些仪器生成的数据的质量。 DSC 是他们测量其技术以及显示高度可靠性的标准，因而 DSC 数据保留在生物物理行业中。  正因为如此，DSC 通常被认为“金标准”。

引用我们一位强调 DSC 效用的用户的话：

“DSC 可能是当前可用的所有生物物理方法中最强大、信息量最丰富且相关性最好的方法。”

Sorina Morar-Mitrica, Ph.D - GlaxoSmithKline; The BioProcessing Summit, 2012

虽然一直都能找到某些生成良好数据的其他技术的示例，我们必须承认也有许多实例证明这些技术不太有用。 因为一些显而易见的原因，这些示例很少公布。

有关这些技术的主要差异，我需要了解些什么？ 

虽然所有供应商都用其术语并有不同的方式展示其仪器和和规格。 但是，您可用于测量蛋白质稳定性的有关仪器的所有考虑必须以了解您的特定应用要求以及产品规格和功能如何影响这些要求为起点。

使用非量热技术测量蛋白质稳定性的大多数供应商直接将其产品定位为与 DSC 相关。 虽然这些产品中的一些在每次处理时更低的样本消耗量方面有特定优势，但这是以信息内容和可重复性为代价 当生成的数据可能有误导性并导致做出不好决定时，节约样本并非优势。  由于不明确的蛋白质稳定性数据代价很高，导致可能需要重复开发项目的大部分。

在购买用于蛋白质稳定性分析的仪器之前要提出的关键问题：

1.我是否想能够使用仪器来评价所有蛋白质/生物治疗候选药物的稳定性？

DSC 适用于所有蛋白质分析，不管存在的色氨酸残基的数量和位置。  

测量内源荧光的其他技术仅是蛋白质稳定性的间接试验。 这些技术实际测量的是随蛋白质去折叠色氨酸残基环境极性的变化。 

这种方法有多种问题。 需要该特定氨基酸残基环境的改变代表整个分子去折叠。 即，色氨酸残基需要深藏于蛋白质核心，并位于多结构域蛋白质的所有结构域。 实际上，不太可能是这种情况。 将不会评价不含有色氨酸残基亚结构域的结构稳定性，这可导致制剂或候选药物选择错误，进而将影响开发流程上的下一个部门。 某些蛋白质甚至不包含色氨酸残基，因此根本无法使用内源荧光方法来进行分析。

图 1：候选生物制品的 DSC 热谱图。 这些数据显示抗体在不同缓冲液中的热去折叠。 这些曲线显示代表抗体 CH2、CH3 和 Fab 区域去折叠的不同峰肩。 下方面板中使用的制剂条件被选中使用，因为其更高的 T_M和更低的 T_1/2

2.我是否想能够表征多结构域蛋白质的所有单个结构域稳定性？

由于 DSC 的可重复性高，以及可监测整个蛋白质结构改变，DSC 可用于清楚测量单个亚结构域的稳定性。 存在光谱技术生成的蛋白质稳定性曲线包括有关亚结构域信息的示例，但也有许多实例表明其无法提供此类数据并且不检测特定结构改变。 这是因为色氨酸残基亚在整个蛋白质中不以适合荧光检测的理想方式分布；一些结构域含有深藏的色氨酸残基，而一些没有。 如果仪器没有检测第一个转变，并由于蛋白质中发生结构改变且用于测量的测量技术无法检测时，容易造成选择不正确的候选制剂缓冲液时，这可能极其重要。 DSC 是一种测量蛋白质稳定性的通用、全局、高分辨率技术，且不会遇到这些类型的问题。

图 2：由内源荧光检测观察到的抗体热去折叠。 曲线没有急剧转变，并因此对于 T_M 确定并不理想。

使用 DSC 监测抗体亚结构域稳定性的另一优势为 Fab 结合区的大小通常大于 CH2 和 CH3 结构域的大小，更容易确定。 大多数光谱技术信号的振幅不是结构域特定的；因此，了解哪个结构域稳定或不稳定非常困难。 这对于蛋白质改造项目和候选药物选择极为重要，因为这两个过程中了解生物制品被影响的部分是至关重要的。

3.我是否想使数据没有会影响结果的实验伪影？

许多低样本消耗的方法使用荧光作为蛋白质稳定性的间接测量值。 除前面描述的问题以外，荧光会遇到一定伪影；特别是淬灭、内滤、聚集和光散射，其在样本浓度的作用下明显改变。 这有两个重要结果。 第一个是当比较不同天和不同实验室的数据时，很难获得重复性数据。因为确保所有共溶质为完全相同的浓度十分困难并且耗时。 第二个是这些伪影可影响去折叠曲线的形状，使得分子在各个批次之间不同，极其主观，并且需要大量经验来正确解读。

某些光谱蛋白质稳定性试验需要使用染料来监测蛋白质稳定性。 这些试验会遇到与内源荧光相同的问题，但此外，染料还可能影响蛋白质本身的稳定性，或缓冲液组分可能影响染料与蛋白质相互作用的程度。 这可导致反应染料和蛋白质相互作用的稳定性曲线因缓冲液组分的干扰更为复杂，且这与蛋白质稳定性本身没有什么关系。 在稳定性曲线用作筛选小分子结合蛋白质药物靶标的间接方法的应用中也是如此。

事实上，DSC 是第一个测量整个蛋白质稳定性的原理技术 - 真正的全局技术 - 意味着其不会遇到以上列出的限制。

4.我是否想要可重复数据？

由于可提供高度可重复性数据，DSC 通常被认为是蛋白质稳定性试验的“金标准”。 正是因为如此，DSC 用于生物相似性和生物相容性研究。 DSC 是近期生物治疗药物（Remsima，Remicade 的生物相似物）批准的成功应用中的关键技术。 另一个示例是 Amgen 团队的工作，他们发现 DSC 是确定被氧化生物治疗产品的最佳技术。 该应用成功背后的原因是 DSC 数据的高度可重复性，以及 DSC 可检测多结构域蛋白质高级结构中微小改变这一事实。

还对 DSC 作为诊断工具确定不同形式癌症的患者的应用进行了研究。 显而易见，DSC 的重复性对于该应用非常关键。 下方是一段引自开展此项工作的团队首席科学家，强调使用马尔文 MicroCal VP-Capillary DSC 获得的 DSC 数据的高度可重复性：

• “尤其适用于无人值守操作来处理大量样本，使人为/意外错误最小。”

• “以出色的扫描可重复性和减少样本使用的可观灵敏度为特征。”

• “使用控制软件简单容易。”

• “通过编程定期清洁/控制扫描易于维护和保持原样。” 

Adrian Velazquez-Campoy - BIFI 研究所 - University of Zaragoza，西班牙

5.我是否想在大范围缓冲液或共溶质条件下测量生物制品的稳定性？

某些技术对兼容缓冲液和/或共溶质有非常具体的要求。 圆二色光谱就是这种限制的一个非常好的例子，由于特定缓冲液（如在制剂研究中使用的）在和蛋白质相同的波长处吸收光，进而导致信号饱和。 除此以外，使用即使很少量的洗涤剂（制剂缓冲液的常见组分）也与大多数基于荧光的技术不兼容。 

DSC 是非光谱技术，不受这些问题影响。

6.我是否需要表征热稳定性高的蛋白质？

DSC 专门设计用于并测量大范围的蛋白质热稳定性，并设计以在低于室温或高温下工作。 相反，光谱技术通常无法在低于 20°C 或高于 90°C 下使用。 热不稳定蛋白质的热变性通常在低于室温时开始发生，使用光谱技术非常容易错过。 在光谱的另一端，尽管许多蛋白质的 T_M 或热转变中点低于 90°C，但通常需要高出 20°C 的温度以正确确定终点。 

这意味着如果任何蛋白的 T_M 约为 70°C，您需要使用 DSC。

7.我是否希望数据易于分析？

马尔文 MicroCal VP-Capillary DSC 使用自动分析软件，去除主观性并使对经验的要求降到最小。 许多同类技术的输出非常主观并难以分析。 这在分析多结构域蛋白质（如抗体）时尤其明显。

”分析软件支持高通量分析，易于使用且不需要任何手动计算，进而节省时间。 这些时间节省特性着实改进了我们的工作流程。”

Katherine Bowers - Fujifilm Diosynth Biotechnologies

8.我是否想检测蛋白质稳定性的微小改变？

DSC 可检测蛋白质结构所有水平的改变（一级、二级、三级和四级），且重复性非常高。  这意味着 DSC 将检测 T_M 中即使非常小的改变，进而检测到高级结构 (HOS) 中的微小改变。

一个近期的示例显示，与多种光谱技术相比，多结构域蛋白质的 DSC 热谱图是检测非期望、低水平 (<5 %) 氧化的生物治疗产品的最佳方法 (Arthur et al, (2015) J Pharm Sci, Vol 104, 1548–1554)。

9.制造商或供应商的口碑如何？

评估您使用产品的制造商或供应商的口碑非常重要，以确保你的投资物有所值。 

DSC 仪器在制造上必须采用高标准，并且应由技术领先、实力雄厚的公司设计，以便获得出版级质量或者可供制定决策的试验结果。

选择具有走在开发和优化这些技术前沿历史的制造商。 这些公司生产的仪器机器间差异小，并且通常是第一个开发此类创新型技术进展及其应用的公司。 另外，他们更有可能掌握专业知识、行业经验和辅助资源，这使得他们不仅能设计和生产出性能极佳的仪器，还能提供适当的支持。

10.售后服务和支持怎样？

购买仪器仅是与供应商/制造商长期关系的开始，因此从提供可接受服务和售后支持的公司购买系统非常重要。

选择一家可提供电话、面对面服务和电子邮件支持、持续培训机会、现场基础服务和专家级支持的公司。 购买仪器之前，询问可提供的支持内容以便了解一旦新仪器在您的实验室安装后，您可期望得到支持的质量和深度。

比较蛋白质稳定性分析平台

上表清楚解释了为什么 DSC 广泛用于整个生物制药行业，并被公认为蛋白质稳定性测量的“金标准”。 近期的论文支持该结论，文中详细描述了当被问及对生物技术药物开发流程中重要应用的技术效用进行排序时，行业内多位专家的回应 (Gabrielson and Weiss IV (2015), Journal of Pharmaceutical Sciences 104:1240–1245)。 包括从候选药物选择和制剂开发到可比性和生物相似性在内的应用。

结论

明确表明 DSC 是用于生物制品稳定性评价的最佳通用技术。 

虽然某些非光谱技术的样本消耗低于 DSC，但他们通常不适用于该应用，因为其固有弱点包括（但不限于）染料干扰、散射、内滤、差/无信号以及亚结构域结构化信息定义差。 

许多这些错误和不兼容性可能导致代价昂贵的不理想决定，进而将导致重新开发项目和/或生物药物没有开发可行性。

马尔文 MicroCal DSC 为每种缓冲液中的每种蛋白质提供可重复且无伪影的金标准稳定性数据。