使用差示扫描量热法加速优化医用蛋白质制剂的研发

治疗用生物分子必须以具有活性的原生形式保持稳定，直到向病人给药并输送到作用部位。 在初期对生物药剂进行稳定性筛选有助于确保进一步研究集中在最有可能用于进一步药物研发的制剂上。 差示扫描量热法 (DSC) 可用于快速确定蛋白质制剂稳定性的最佳溶液条件，有助于确定最佳候选制剂并加速研发过程。 本应用报告对 Malvern MicroCal DSC 技术和其在制剂研发中的使用进行了说明。 

简介

生物药剂研发中一个较早的决定是确定生物药剂将以液体还是冻干粉的形式提供。 一般而言，液体制剂生产成本较低，更易于使用，但需要在冷藏条件下储存，且稳定性较差。 冻干蛋白质生产成本较高，且在向病人给药前需要溶解，但是其可以在室温条件下存放，且稳定性较高。 方便最终用户也是需要考虑的因素 (1,2)。 制剂科学家必须确定溶液中的蛋白质是否能在足够的时间段内保持稳定性，还是只能以冻干形式保持稳定。

水溶液中的蛋白质处于天然（折叠）和变性（去折叠）构象之间的平衡状态。 疏水作用和氢键结合是主要的稳定力，是蛋白质去折叠和变性必须克服的力。 构象熵会削弱稳定力，因而允许生物聚合物去折叠 (3)。 蛋白质在加热或变性化学物（例如十二烷基硫酸钠和盐酸胍）被添加到溶液中时发生去折叠。 变性的蛋白质更易于 (4-7) 发生不可逆的化学过程，例如蛋白质水解 (8)、氧化 (9) 和脱酰胺 (10)，继而导致失活。 变性的蛋白质还更容易发生聚合，而且聚合会导致稳定性下降和蛋白质分解 (11-14)。

在研发制剂前，必须对蛋白质进行表征。 这包括确定其分子量、氨基酸组成、三维结构、是否存在二硫键、糖基化反应、辅因子要求、抑制因子、溶解度、热力学参数、功能性、等电点、疏水性和表面面积。 所有这些信息对设计蛋白质的最佳制剂而言都非常重要。 通过使用合理的药物设计方法，经过生物工程改造的蛋白质也可改造为在所选溶液中保持最高的稳定性和最大的功效。

蛋白质的液体制剂应有助于在生产、包装、储存和运输期间保持生物聚合物的稳定性和生物活性，直至最终输送到病人体内的靶部位。 在制剂研发过程中需要考虑的参数包括浓度、是否存在添加剂（辅料）、pH、储存温度、容器以及光、空气和湿度的曝露程度。

制剂研发过程中涉及的另一个因素是药物输送机制。 例如，通过静脉注射输送的生物药剂须为可稀释的，如果该蛋白质不易溶，其会在病人血液中沉淀。 此外，如果是注射药物，则制剂的成分不可对病人造成组织损伤或疼痛。 另一点需要考虑的是容器或装置表面（注射器、泵等）可能会吸收蛋白质。

蛋白质的稳定性通常使用各种分析方法确定，包括加速和实时稳定性研究。 通常还会评估聚合/沉淀的程度、氧化、蛋白降解和/或二硫键重排。 对运输条件进行测试，以确保药物在输送时不会失去生物活性。

DSC 和制剂研发

差示扫描量热法 (DSC) 是用于直接以天然形式表征生物分子稳定性的微量热法。 该方法通过测量在以恒定速率加热时与分子热变性相关的热能改变测定稳定性。 测定热跃迁中点 (T_m) 可提供快速、简易的稳定性指示。 T_m 值越大，生物分子越稳定。

DSC 仪器上配备含有生物分子与缓冲液的样品池以及一个只有缓冲液的参比池。 接通加热器电源，以恒定速率提高样品池和参比池的温度。 在温度升高时，仪器监控样品池和参比池之间的温度差别。 两个池维持相同温度所需吸收的热量差决定了表观过剩热容（图 1）。 焓变跃迁的温度中点 (T_m) 发生在蛋白质从天然形式变为变性形式时。 在达到 T_m 时，50% 的蛋白质处于天然状态，50% 处于变性状态，呈现两态跃迁（图 1）。 有些拥有不同活性区或多个结构域的蛋白质可以有多个 T_m。 科学家可以重点研究一个或两个因配方改变而表现出最大影响的 T_m 值。

T_m 是热稳定性的指标，一般而言，T_m 越高，蛋白质越稳定。 T_m 越高，蛋白质在低温环境中也越不容易去折叠和变性。 通过探索各种条件和添加剂，DSC 可确定具有最高 T_m 的制剂，这就相当于稳定性最佳的制剂 (4,5,7,15,16)。

在化学过程中，要么释放热量（放热），要么吸收热量（吸热）。 蛋白质从天然转变到变性的跃迁过程通常是吸热的。 构象跃迁期间的焓 (∆H) 变化是通过对跃迁下方的区域进行积分来测定（图 1）。 变性蛋白质的热容 (C_p) 通常比天然蛋白质的高，从而导致热变性的 ∆C_p 为正（图 1）。

图 1：典型的 DSC 热分析图。 该 DSC 扫描在稀释蛋白质溶液上进行，该蛋白质从低温下的紧凑、天然状态跃迁到高温的去折叠、变性状态。 蛋白质的表观过量热容根据蛋白质在缓冲液中的热容与单独缓冲液的热容之间的差别测定。 使用非线性最小二乘回归分析将数据与两态跃迁模型拟合，从而计算跃迁的 Tm、∆H 和 ∆Cp。

在研究溶液中的生物聚合物时使用 Malvern MicroCal™ VP-Capillary DSC（图 2）和 Malvern MicroCal VP-DSC 系统。 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 系统专为筛选多个制剂的 T_m 设计，可实现较高的样品处理量（24 h 内最高处理 50 个样品），同时扫描速率很快（最高 250°C/h）。 完全一体化的自动进样器允许无人照看操作。 有关 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 和 Malvern MicroCal VP-DSC 系统的特点对比，请参见表 1。

##图 2：Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 系统。

液体制剂策略

在制剂研发中，主要的问题是确定何种溶液条件可以为天然蛋白质提供最大的稳定作用。 产生最高 T_m 的条件通常使蛋白质在最长的时间内以及在低温环境中保持在天然状态。 首先使用 DSC 筛选不同的 pH 和缓冲液条件，然后筛选辅料和防腐剂。

缓冲液和 pH 优化

图 3 显示了蛋白质 CD40L 的 T_m 与 pH 的函数关系。 此外还测定了在 37°C 环境中存储 7 天后 CD40L 的聚合情况。 T_m 最佳的 pH 条件与在聚合程度最低时的 pH 条件相一致 (16)。 在对巨噬细胞集落刺激因子的研究中也看到 pH、T_m 和聚合之间的这一关联性 (4)。

图 3：CD40 配体 (CD40L) 的稳定性行为与 pH 作图，将 (A) 通过尺寸排阻色谱 (SEC) 确定的聚合响应和 (B) 通过 DSC 测定的 Tm 关联起来。 括起来的区域代表 Tm 最大且聚合程度最低时的最佳 pH 范围。 资料来自参考文献 (16)。

通过 DSC 测定蛋白质 T_m 的变化是相对简单的过程。 图 4 显示了当 pH 增加时，胰凝乳蛋白酶原的 T_m 变化，使用 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 测定。 T_m 随 pH 增加而增加，这指示 pH 较高时天然形式的胰凝乳蛋白酶原稳定性更高。

图 4：胰凝乳蛋白酶原的 Tm 随 pH 变化。 制备胰凝乳蛋白酶原溶液（pH 1.96、2.27、2.57 和 3.02）并添加到 96 孔板中。 每个 pH 使用五个样品。 相匹配的的参照缓冲液也放在 96 孔板中。 使用 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 进行 DSC 扫描。 此处所示的数据已去除参照缓冲液背景。 图中有各 pH 的 Tm 数据和标准偏差。

辅料

辅料是可提高蛋白质稳定性的添加剂。 它们包括糖、氨基酸、抗氧化剂、聚合物、酒精、丙三醇和表面活性剂。

确定最佳 pH 和缓冲液后，将不同的辅料添加到蛋白质溶液中。 如果辅料提高 T_m，则蛋白质的天然形式在有该辅料时比没有时更稳定。

在白介素-1 受体 IL-1R 的液体制剂研发过程中使用了辅料筛选 (5)。 IL-1R 有两个主跃迁，一个在 T_m 接近 48°C 时，另一个是接近 66°C 时。 选择 T_m 温度较低时的跃迁筛选辅料。 该策略的目的是寻找可提高低温跃迁 T_m 的辅料，这指示天然蛋白质稳定性有积极改变。 筛选了 23 种辅料（表 2）。

离子强度

调节缓冲液的离子强度，以确定是否可以通过添加盐提高 T_m。 对于 IL-1R，添加 100 mM NaCl 可产生最大程度的稳定化影响，在适度的离子强度下 T_m 从 48°C 变为 53°C。 这种稳定化影响表明盐离子与蛋白质的带电基团有直接的相互作用 (5)。 IL-1R 的 T_m 随着盐浓度增加而增加，甚至在 NaCl 为 1500 mM 这种远高于使所有带电部位饱和所需的浓度时也是如此（图 5）。 这些数据表明，盐离子影响水结构，而水结构也对蛋白质的构象稳定性有重要影响。 电荷间交互作用和水结构的改变都可以提高天然 IL-1R 结构的稳定性。

图 5：添加 NaCl 的 IL-1R Tm 图。 虚线显示的是 100 mM 浓度。 资料来自参考文献 (5)。

防腐剂

当药物采用多剂量形式提供时，需要添加防腐剂预防微生物生长。 然而，这些防腐剂可能会减弱蛋白质的稳定性。 防腐剂对 IL-1R T_m 的影响也有人进行了研究 (5)。 两个温度跃迁都向更低温度移动，表明防腐剂间甲酚、苯酚和苯甲醇会降低 IL-1R 的稳定性（表 3）。 DSC 数据确定了 IL-1R 在三种防腐剂中的稳定性顺序 — 苯酚产生的 T_m 最高，然后是间甲酚和苯甲醇。 通过尺寸排阻色谱 (SEC) 测定可知，DSC 稳定性数据也与 IL-1R 的聚合相关联。 T_m 越高，在 7 天和 60 天后观察到的聚合越少。

根据 T_m 筛选得出的最佳候选制剂在之后通过加速稳定性研究进行评估。 在不同制剂中制备蛋白质，然后在 37°C 环境中储存。 在加速稳定性研究期间通过定期进行尺寸排阻色谱分析确定聚合量，并使用 SDS-PAGE 分析蛋白质以确定是否发生蛋白质水解。

最后，必须对最佳候选制剂进行实时稳定性研究，以确定蛋白质的保质期。 在整个研究过程中进行生物鉴定和分析试验，确保蛋白质具有活性和功效。

DSC 在制剂研发期间用作评估蛋白质稳定性的筛选工具已有很多年的历史，且与 Malvern MicroCal VP-DSC 相比，使用自动化的 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 可以更快地进行筛选，同时可提高通量（表 1）。 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 已用于确定蛋白质在不同 pH 和辅料条件下的 T_m，且 T_m 的变化与 SEC 数据相一致，支持将 DSC 作为稳定性筛选工具 (17)。

总结

DSC 数据对于预测蛋白质在溶液中的稳定性非常有用。 T_m 指示热稳定性，而不同制剂中的 T_m 测定是低温条件下对聚合及其他不可逆变化的敏感性的近似测量。 已选择具有最佳热稳定性的制剂用于进一步的稳定性、保质期和运输研究。 使用 DSC 可节省制剂研发中的时间和资金，且全自动系统可提高此药物研发关键领域的效率和生产率。

参考文献：

1. BioPharm Guide to Formulation, Fill and Finish, 2001, supplement to BioPharm (Advanstar Communications).

2. McNally, E.J., ed., Protein Formulation and Delivery Marcel Dekker, Inc, New York 2000.

3. Pace, C.N. et al. FASEB J 10, 75-83 (1996).

4. Schrier, J. A. et al. Pharm Res 10, 933-944 (1993).

5. Remmele, R.L., Jr. et al. Pharm Res 15, 200-208 (1998).

6. Davio, S.R. et al. Pharm Res 12, 642-648 (1995).

7. Chan, H.K. et al. Pharm Res 13, 756-761 (1996).

8. North, M.J. In Proteolytic Enzymes: A Practical Approach (Beynon, R.J. and Bond, J.S., eds.) IRL Press, Oxford, pp 105-124 (1993).

9. Powell, M.F. In Formulation and Delivery of Proteins and Peptides (Cleland, J.L., Langer, R, eds.) American Chemical Society, Washington DC, pp 100-117 (1994).

10. Wearne, S.J. and Creighton, T.E. Proteins 5, 8-12 (1989).

11. Chen, B. et al. Pharm Res 11, 1581-1587 (1994).

12. DeYoung, L .R. et al. Biochemistry 32, 3877-3886 (1993).

13. Martinez, J.C. et al. Biochemistry 33, 3919-3926 (1994).

14. Mitraki, A. et al. Eur J Biochem 163, 29-34 (1987).

15. Chen, B.L. and Arakawa, T. J Pharm Sci 85, 419-426 (1996).

16. Remmele, R.L., Jr. and Gombotz, W.R. BioPharm 13, 36-46 (2000).

17. Burton, L. et al. Pharm. Dev. Technol. 12, 265-273 (2007).