단백질의 안정성은 바이오 제약 개발의 성패를 가름하는 결정적인 요인입니다. 단백질의 안정성은 생산, 제조, 포뮬레이션, 장기 보관, 환자에 대한 전달 및 효능에 있어 중요한 매개 변수입니다. 높은 안정성을 가진 단백질은 제조 공정 중에 문제가 발생할 가능성이 더 낮고, 생산의 경제성이 더 높고, 포뮬레이션 및 보관 중에 화학적 변화나 응집 없이 기능을 유지할 가능성이 더 높습니다. 바이오 제약 개발에 대한 “설계에 의한 품질”(Quality by Design, QbD) 접근법에서 안정성 특성 분석은 잠정 후보 약물의 “개발 가능성” 또는 “약물화 가능성”을 평가하는 데는 물론 공정 개발 및 제조 중에도 지속적으로 활용됩니다. 안정성 데이터는 또한 제조 지원, 생물학적 동등성 평가에 사용되는 고차원 구조(HOS) 특성 분석 및 ‘지문 분석’에도 활용됩니다. 단백질 HOS 특성 분석은 바이오 제약 분야의 새로운 신약과 바이오 시밀러에 대한 규제 제출물에서 점점 더 그 요구가 늘어날 것으로 기대되고 있습니다.
단백질의 복잡한 속성으로 인해 생물물리학적 특성 분석 도구는 바이오 약품의 완벽한 특성 분석에 있어 중요합니다. 원이색법(CD), 동적 및 정적 광산란(DLS 및 SLS), 크기 배제 크로마토그래피 다각도 광산란(SEC-MALS), 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR), 분석적 한외 여과(AUC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 시차 주사 형광측정법(DSF), 고유 형광측정법(IF) 및 시차 주사 열량측정법(DSC)와 같이 단백질 안정성을 평가하는 데 흔히 사용되는 몇가지 생물물리학적 도구들이 있습니다.
이러한 생물물리학 분석법은 모두 바이오 제약 개발에 있어 중요한 역할을 하며 DSC에 의한 열적 안정성의 특성 분석은 필수적입니다. 단일클론 항체 고차원 구조 특성 분석을 위한 생물물리학 기술에 관한 2015년 논문, Gokarn 외 언급: "DSC는 주어진 완충액 조건에서 단백질의 안정성을 평가하기 위한 최고의 기법으로 유지되고 있음”[1].
이 백서는 DSC를 사용하여 단백질 바이오 약제(주로 항체)의 열적 안정성을 분석하는 것과, 바이오 약제의 비교성(배치 대 배치 비교, 공정 변경의 효과 등) 및 바이오 시밀러 개발을 위한 HOS 특성 분석 도구로서의 DSC에 중점을 두고 있습니다.
DSC는 미세 열량측정 기법으로서 단백질, 핵산, 지질 및 기타 바이오 고분자의 열적, 구조적 안정성을 분석하는 데 사용됩니다[2-7]. DSC는 온도의 작용에 따른 열용량을 측정합니다. 본 백서에서 설명된 단백질 특성 분석에 사용되는 DSC 장비는 ‘배율 보상’ 장비로서 바이오 고분자 용액을 적절히 고정된 샘플 셀에 배치하고, 대응되는 기준 셀에 완충액을 채워 분석을 수행합니다. 샘플 셀에서 얻은 열 용량(Cp) 신호는 기준 셀의 신호와 비교됩니다. 셀의 온도가 증가함에 따라 기준 셀과 샘플 셀 사이의 온도 차이가 지속적으로 측정되고 배율 단위로 보정됩니다. DSC는 단백질을 증가하는 온도에 노출시켜 단백질의 풀림이 시작되면 그에 따른 단백질의 Cp 증가를 측정하기 때문에 ‘강제 분해 분석법’이라 할 수 있습니다(그림 1).
그림 1: DSC의 작동 방식. 단백질의 열적 변성에 따른 열용량(Cp) 변화. DSC 실험은 단백질이 주로 네이티브 형태에서 접힌 상태인 온도에서 시작합니다. 온도가 증가함에 따라 어느 순간 단백질의 풀림/변성(Tonset)이 시작되고 Cp가 증가합니다. 단백질 중 50%가 네이티브 형태이고 50%가 변성되는 온도에서 Cp는 최대값에 도달합니다. 이를 열전이 중간점 또는 TM이라 합니다. TM에서는 단백질이 주로 변성된 상태이며 DSC 실험의 말미에는 모든 단백질이 풀린 형태가 됩니다. DSC의 실험 변수에는 Tonset, TM, 풀림 엔탈피(ΔH)가 있습니다.
DSC는 형광 물질이나 기타 표지 또는 프로브 없이 열용량 변화를 직접 측정합니다. 변성이 가역적인 단백질의 경우에도 용융 또는 변성 온도라고도 하는 열전이 중간점(TM)은 단백질의 50%가 네이티브(접힘) 형태이고 50%는 변성된 형태가 되는 온도를 말합니다. TM은 DSC 서모그램의 ‘피크’로 측정합니다.
TM은 우수한 열적 안정성 지표로 여겨집니다. 즉, TM이 높을수록 단백질이 열적으로 더욱 안정적인 것입니다. 여러 영역 단백질(항체 등)은 일반적으로 DSC 서모그램에서 하나 이상의 피크를 가지므로 각 영역에서 하나 이상의 TM을 측정할 수 있습니다(그림 2 참조).
그림 2: CH2, Fab, CH3 영역을 식별한 단일클론 항체의 대표적 DSC 서모그램. 빨간색 점선은 각 영역 전이의 디콘볼루션 피크로 3개의 TM이 표시되어 있습니다.
DSC는 단백질 안정성의 특성을 분석하고 순위를 결정하는 데 사용할 수 있는 풀림 엔탈피(ΔH, 곡선 아래의 면적으로 측정)와 같은 다른 유용한 매개 변수를 제공합니다. 단백질 풀림은 단백질을 접힌 상태로 유지하는 2차 비공유 결합을 파괴하는 데 에너지 입력이 필요하기 때문에 흡열 과정입니다. DSC는 또한 Tonset(풀림 시작), ΔCp(풀림의 열용량 변화), T1/2(1/2 피크 높이에서의 너비, 풀림 서모그램의 형태를 나타냄)도 측정합니다. DSC 분석에는 이러한 매개 변수 조합에 대한 측정을 포함할 수 있습니다.
대부분의 단백질 변성은 비가역적이고 열적 변성 이후 응집하거나 침전하는 경향이 있습니다. 비가역적 변성 단백질의 DSC 분석에서 얻은 TM 및 기타 매개 변수는 진정한 열역학 매개 변수가 아닙니다. 그러나 비가역적 단백질 변성에 대한 DSC 분석에서 얻은 TM의 순위는 안정성 선별을 위해 아주 유용한 정량적 매개 변수입니다.
Malvern Instruments는 용액 내 단백질 및 바이오 고분자에 대한 TM 선별 및 열역학적 특성 분석을 위해 설계된 자동 DSC인 MicroCal VP-Capillary DSC 시스템[8,9]을 제공합니다.
그림 3: 바이오 제약 발견 및 개발 과정의 일반적인 체계
그림 3은 바이오 제약 발견 및 개발 파이프라인의 일반적 체계를 보여주고 있습니다. 녹색 부분은 안정성 분석 등의 생물물리학 특성 분석이 가장 흔하게 이용되는 부분입니다(더 나아가 본 백서의 끝에 바이오 제약의 발견 및 개발에 대한 “권장 읽을거리” 목록이 있음).
과학자들은 원하는 바이오 약제를 개발하면서 후보 물질을 선정할 때 이미 높은 안정성이 입증된 바이오 분자를 먼저 살펴본 다음 단백질 엔지니어링을 통해 안정성을 높여야 한다는 결론을 이끌어 내야 할 수 있습니다. 정제 중에 단백질은 보통 안정적이고, 정확히 접혀 있고 활성인 상태에서 제거되므로, 이 과정에서 단백질을 가능한 한 안정적으로 유지하는 완충액, 첨가제, 정제 방법 및 보관 조건을 사용하는 것이 매우 중요합니다.
포뮬레이션된 피하(SC) 단백질 약물은 안정적이며 적합한 용기(바이알 또는 프리필드 주사기 등)에 밀봉해 놓으면 아주 높은 단백질 농도(약 100mg/mL)인 경우에도 일반적으로 수년 동안 영향을 받지 않습니다. 단백질 분자는 바이오 약제 생산 및 포뮬레이션 과정에서 빈번히 발생하는 열, 화학물질, pH 변화, 압력, 혼합, 고농도와 같은 스트레스 요인에 노출되면 단백질 구조가 모두 변성된(풀린) 단백질이 되기 쉽습니다. 용액 내 단백질도 변성된 비활성 단백질로 이어질 수 있는 탈아미드화 및 산화와 같은 변이에 영향을 받기 쉽습니다. 단백질 바이오 약제의 경우 변성 및 기타 변이로 인해 응집물이 형성되어 제품의 효능이 감소하거나 약물로서 기능을 상실하게 될 수 있습니다. 더욱 중요한 점은 단백질 응집으로 인해 잠재적으로 치명적인 면역원성 반응이 환자에게 나타날 수 있다는 것입니다. 바이오 제약의 기반으로서 안정적인 단백질 약물을 사용하면 더욱 경제적인 생산이 가능하며 성공적이고 안전하고 효과적인 약품을 얻을 수 있습니다.
아미노산 배열, 즉 단백질의 일차(1°) 구조는 폴리펩티드 사슬과 단백질 구조에서 가장 기본적인 구성 요소입니다. 이보다 중요한 것은 고차원 구조(HOS)라고도 하는 단백질의 3차원 구조를 이해하고 분석하는 것입니다. 단백질 HOS에는 3가지 수준이 있습니다. 이차(2°) 구조는 α 나선, β-면, 회전형 및 불규칙 나사선 등 단백질 1차 구조의 국부적인 접힘 구조를 말합니다. 3차(3°) 구조는 2차 구조 요소의 배열에서 발생하는 단백질의 최종적인 3차원 구조를 말합니다. 4차(4°) 구조는 2개 이상의 동일하거나 서로 다른 폴리펩티드 사슬의 상호 작용이 수반되는 구조를 설명합니다.
DSC는 열적으로 변성될 때 발생하는 3차 및 4차 구조의 구조적 안정성 및 변화를 측정하는 것은 물론 내재적, 외부적 요인이 단백질 안정성에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 암시를 제공합니다. DSC는 장기 안정성에 대한 예측 인자로서 바이오 제약 단백질의 특성 분석에 사용되는 가장 정량적인 최고의 열적 안정성 분석법으로 평가되고 있습니다[1,10-14]. DSC의 TM은 안정적인 단백질일수록 더 높은 TM을 가진다는 사실을 통해 후보 물질 선정(개발 가능성), 포뮬레이션 선별, 공정 개발에서 안정성의 순위를 분석하는 데 흔히 사용되는 매개 변수입니다. DSC의 엔탈피(∆H),Tonset, T1/2,ΔCp는 안정성 순위 결정, DSC 데이터 검증, 단백질 풀림의 정량 분석, 고차원 구조 ‘지문 분석’에도 사용됩니다[10-14].
정의된 용액 조건에서의 단백질 DSC 분석은 단백질이 같거나 매우 유사한 경우 재현성이 높고 정량적입니다(그림 4). 즉, DSC 서모그램이 유사한 패턴을 가지며 매개 변수(TM, ΔH 및 Tonset 등)가 허용 범위 내에 있게 됩니다[12-14]. 비교되는 서모그램이 다르고 DSC 피팅 매개 변수가 변하는 경우 이는 단백질 잘못 접힘, 분해, 응집, 용액의 변경, 전사 이후 변이의 변화와 같은 사건이 있었거나 기타 고차원 구조 변화가 발생하여 단백질의 구조적 안정성에 영향을 미쳤다는 것을 의미합니다.
DSC는 재현 가능하고 정량적인 데이터를 제공하기 때문에 제조 중 제품 평가를 위한 비교성 및 HOS 분석(배치 대 배치 및 현장 대 현장 비교 등), 단백질 변이형 및 수정 제품의 비교(글리코실화, 탈아미드화, 산화 등), 생물학적 동등성을 위한 핵심적인 분석법입니다. DSC 데이터는 또한 신약 및 바이오 시밀러 관련 제출물에서 HOS 특성 분석으로서 규제 근거 문서로도 사용됩니다. 바이오 제약 산업의 과학자에 대한 설문조사에서 DSC는 후보 물질 선정, 포뮬레이션 개발, 제품 특성 분석, 비교 연구, 공정 개발, 생물학적 동등성 연구를 수행할 때 ‘아주 유용한’ 또는 ‘몹시 유용한’ HOS 생물물리학 도구로 평가되었습니다[15].
그림 4: PBS의 소 혈청 알부민에 대한 19개 DSC 서모그램(Sigma A1933, 크로마토그래피 방식으로 정제). 주사 속도 정규화, 완충액 대 완충액 제거, 통합 기준선 제거 후 표시된 DSC 데이터. Tonset, TM1, TM2의 평균과 표준편차가 표시되어 있습니다.
항체와 같은 여러 영역 단백질의 경우 DSC 서모그램은 하나 이상의 풀림 전이를 갖습니다(그림 2 참조). DSC는 여러 영역을 분석하고 정량화할 수 있으며 각 전이에 대해 개별적인 TM을 측정할 수 있습니다. 서모그램에서 피크로 나타나는 TM 값은 복잡한 데이터 분석 없이 DSC 데이터에서 간단히 측정할 수 있습니다. TM을 측정할 수 있는 CD, IF, DSF와 같은 대체 생물물리학 분석법은 가장 낮은 온도에서 발생하는 첫 번째 TM만 검출할 수 있거나 여러 영역 단백질에서 가장 ‘주된’ TM만 검출할 수 있습니다. 분광법 또는 형광측정법 데이터에서 하나 이상의 TM을 추출하려면 복잡한 데이터 피팅이 요구되며 재현이 불가능할 수 있습니다.
DSC는 다른 TM 선별 분석법과 비교하여 더 많은 주사당 단백질 샘플이 필요하며 처리량이 낮을 수 있습니다. 샘플이 제한된 경우 한가지 좋은 해결책은 DSF 또는 IF로 초기 TM 순위 분석을 수행한 다음 몇 개의 샘플을 선택해 DSC로 TM을 검증하는 것입니다. 안정성 평가를 위해 TM을 계산할 때 형광측정법이나 분광법만을 단독으로 사용하는 것보다 DSC로 TM 결과를 검증하는 것이 중요합니다. 형광 기반 분석법은 출력 데이터와 간섭을 일으키는 아티팩트(artifact)가 나타나는 경우가 흔하며, 이러한 아티팩트 때문에 TM 결과가 더 높거나 낮게 이동한 것처럼 보일 수 있습니다. 일부 단백질 및 완충액 조건은 형광측정법에 적합하지 않으며 이로 인해 TM의 차이를 계산하는 과정이 매우 복잡할 수 있습니다. 결론적으로 형광측정법과 분광법은 열량 측정 엔탈피와 기타 열역학 매개 변수를 측정할 수 없는 반면 DSC는 열적 안정성에 대한 ‘데이터 집합’으로서 이러한 정보를 모두 제공할 수 있습니다.
DSC는 다음과 같은 이유로 바이오 제약 산업에서 ‘절대적 표준’의 열적 안정성 분석법으로 여겨지고 있습니다.
단백질 풀림과 관련한 열 변화를 측정합니다.
단백질 풀림을 직접 측정하므로 표지, 프로브 또는 태그가 필요하지 않습니다. 따라서 형광측정법이나 기타 분광법에서 흔히 나타나는 잠재적인 검출 아티팩트가 없습니다.
용액 내 네이티브 단백질을 측정하고 바이오 제약 정제 및 포뮬레이션 개발에 흔히 사용되는 거의 모든 완충액 및 첨가제와 함께 사용할 수 있습니다. 형광측정법과 분광법에서는 이중 일부 완충액과 첨가제가 호환되지 않습니다.
실험실 환경에서 사용하기 쉽습니다.
정밀한 온도 제어가 가능하고 작동 온도 범위가 최대 130°C에 달하기 때문에 대부분의 고온 TM 전이를 검출할 수 있습니다. 다른 TM 선별 분석법은 샘플을 100°C(또는 그 이하)까지만 가열합니다.
‘강제 분해’ 분석법으로서 분석 전에 완충액에 단백질을 보관할 필요가 없습니다. SEC-HPLC 및 DLS는 형태의 변화를 검출하기 위해 높은 온도의 완충액에서 샘플을 배양해야 하는 경우가 많습니다.
간편한 데이터 출력 및 통합 데이터 분석 소프트웨어를 갖추고 있습니다.
분리된 풀림 전이를 확인하고 여러 영역 단백질, 단백질 복합체는 물론 간단한 단일 영역 단백질을 분석할 수 있습니다.
열역학 데이터 외에도 구조적 안정성 및 TM 측정 데이터와 같은 풍부한 정보를 제공합니다.
바이오 치료제의 열적 안정성 분석을 위한 기본 분석법으로 사용할 수 있으며, 독립적이거나 상호 보완적인 기타 생물물리학 선별 도구와 함께 사용하거나 다른 데이터를 검증할 수 있습니다.
열적 안정성의 신속한 선별을 위해 높은 처리량을 제공하는 자동 시스템(MicroCal VP-Capillary DSC 시스템)을 이용할 수 있습니다.
바이오 제약 비교 연구
단일클론 항체 및 기타 바이오 제약 약물은 포유류 또는 세균성 세포에 의해 발현되는 단백질 복합체입니다. 각각의 단백질은 고유하기 때문에 이를 약물로 전환하려면 광범위한 연구, 특성 분석 및 최적화가 필요합니다. 발견 및 초기 개발 단계의 일환으로 순도, 역가, 투여량 등 단백질 약물에서 원하는 특성이 정의됩니다. 이러한 특성들을 연구하기 위해 생화학, 생물물리학 및 생물학 분석법이 개발되어 제품 개발 전반에서 최적화되고 있습니다.
제품 수명 주기 전체에서 공정을 제어하고 검증하는 데 필요한 단백질의 핵심적 품질 특성 및 공정 매개 변수를 정의하기 위해 각 공정에 대해 상세한 단백질 특성 분석과 HOS(안정성 포하)이 수행됩니다. 바이오 제약 개발에 대한 “설계에 의한 품질”(Quality by Design, QbD) 접근법에서는 핵심적 품질 특성 및 안정성 특성 분석이 공정 개발 및 제조 지원 시 약물 평가에 포함됩니다[16,17].
단백질 약물의 처리 중에 단백질은 다음과 같은 여러 가지 조건에 노출됩니다.
다양한 완충액, pH, 염분을 포함한 서로 다른 용액
포뮬레이션 첨가제(부형제).
넓은 범위의 단백질 농도
반복적인 동결/해빙 주기, 압력 증가 및 혼합/섞임
단백질이 접촉하는 여러 가지 소재 표면(펌프, 한외여과/디아필트레이션 막, 크로마토그래피 매질 등)
산화제, 포타아제, 세포 성장 배지, 제품 변이 등에 대한 노출
이러한 조건들은 단백질을 원래의 접힌 형태로 유지하는 힘과 상호작용을 방해하여 단백질의 변성이나 비활성화를 유발합니다. 산화, 탈아미드화, 글리코실화의 변화 또는 기타 전사 이후 변이로 인한 화학적 변성도 발생할 수 있습니다.
변성된 단백질은 종종 바이오 제약 개발의 핵심적인 문제인 응집물을 발생시킵니다. 응집물은 단백질 단량체의 상태와 관련되어 있고 응집물의 형성은 가역적이거나 비가역적일 수 있으며, 단백질 다이머부터 육안으로 볼 수 있는 대형 입자까지 크기가 다양합니다. 단백질 응집은 최소한 약물의 효능 및 역가를 줄이고 생산 비용을 높이게 됩니다. 단백질 응집물과 입자에 대한 더 큰 우려 사항은 면역원성 반응을 높여 극단적인 경우 환자를 사망에 이르게 할 수 있다는 점입니다. 이러한 문제로 인해 단백질 응집은 바이오 제약 산업 내에서 상당한 감시를 받고 있습니다. 이러한 예에는 입자/응집 검출, 생산 및 포뮬레이션 중 정량화 및 특성 분석, 바이오 의약품의 단백질 응집을 줄이거나 없애기 위한 해결책의 탐색이 있습니다.
제조된 단백질 약물이 구조, 안정성, 사이즈 분포, 생화학적/기능적 분석 면에서 다음의 대상과 비슷하다는 것을 입증하는 것이 중요합니다.
이전 로트 및 기준 단백질 로트에서 제조된 동일한 단백질
다른 현장에서 제조된 동일한 단백질
수정된 업스트림 및 다운스트림 프로세스를 사용하여 제조된 동일한 단백질
업스트림 또는 다운스트림 프로세스의 확장
다른 포뮬레이션으로 제조된 동일한 단백질
제조된 단백질 제품이 지정된 핵심 품질 특성 면에서 기준 단백질과 비교하여 ‘매우 유사’하다는 것을 입증하기 위해 비교성(또는 생물학적 동등성)에 대한 생화학적/생물물리학적/HOS/기능적 분석법이 설계됩니다. 각 개발 단계에서 단백질 후보 약물의 HOS를 신중히 분석하는 것은 필수입니다.
바이오 제약의 제조 공정 변경은 공정 개발 중이나 약물 승인 후에도 있을 수 있습니다. 이러한 변경에는 다음과 같은 이유가 있습니다.
제조 공정의 개선(예: 제품 산출량, 원가 절감)
규모 확대
제조 환경 변경
준수 및 규제 변경
제품 안정성 개선
제조 공정에 중대한 변경이 있는 경우 바이오 의약품의 핵심 품질 특성, 안전성 및 효능에 대한 변경의 효과를 평가하기 위한 비교 연구 작업이 수행되어야 합니다. 비교성의 입증은 반드시 변경 전 제품과 변경 후 제품의 핵심 품질 특성이 동일해야 한다기보다 매우 유사해야 한다는 것을 의미합니다. 제조 변경은 제품 품질에 부정적인 영향을 미쳐서는 안됩니다.
비교성은 단백질 치료제에 있어 중요한 사항으로서 여러 국제 규제 기관에서 다루고 있습니다[18,19,20]. 단백질 약물의 비교성 평가에 사용할 수 있는 단일한 분석법은 없습니다. HOS 및 비교성 연구에는 DSC, DLS, 형광측정법, CD, AUC, SEC, 라만 분광법, 나노 입자 추적 분석법(Malvern Instruments의 NanoSight), 공명 질량 측정법(Malvern Instruments의 Archimedes), 현미경법 등 다수의 분석법이 있습니다. 단백질 생물 활성도 및 효능은 생물학적 분석법, 등온 적정 열량측정법(ITC) 및 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통해서도 모니터링됩니다.
각각의 생물물리학적 방법이 제공하는 정보는 특정되어 있기 때문에 이를 함께 평가하면 HOS 특성 분석 및 비교 연구를 위한 구조적 정보를 얻을 수 있습니다. HOS ‘지도’는 공정 개발 주기 중 확장 수행 시, 로트 대 로트 비교 연구 시, 공정을 새로운 제조 현장으로 이전할 때, 생산에 수정을 가할 때 단백질 구조의 일관성을 확보하는 데 도움이 됩니다. HOS 특성 분석에서 얻은 정보는 바이오 시밀러를 평가하는 데도 유용합니다.
제조 공정 중 비교성을 테스트하고 확립하는 것은 바이오 시밀러 약품의 개발 중에 수행되는 테스트와 같지 않다는 점을 알아두는 것이 중요합니다. 바이오 시밀러 개발은 훨씬 더 복잡한 과정입니다. 바이오 시밀러는 일반적으로 선도 제품(모제품 또는 기준 제품이라고도 함)을 개발한 기업에서 생산하지 않습니다. 바이오 시밀러는 새로운 업스트림 및 다운스트림 프로세스를 확립하기 위한 ‘역엔지니어링’이 필요합니다. 바이오 시밀러 제조업체는 제품 품질(생물학적 동등성)을 좁은 범위 내에서 선도 업체의 상용 제품 품질과 대등하게 만들어야 하며, 이때 생물학적 동등성을 입증하기 위해서는 일반적으로 제조 시 비교성을 보여주는 데 필요한 것 이상의 추가적인 생물물리학적, 생화학적 증거가 요구됩니다.
DSC는 다양한 용매 조건 하에서 단백질의 열적 안정성에 대한 정보를 제공하고 DSC 결과의 재현성이 높기 때문에(그림 4) 공정으로 인해 제품 안정성의 변화가 발생하지 않으며 다른 로트 및/또는 제조 현장에서 제조된 제품이 높은 유사성을 가진다는 것을 보여주기 위해 DSC가 종종 비교 연구에 포함됩니다.
Jiang과 Nahri[21]는 공정 개발 및 제조 중의 비교 연구를 위해 여러 가지 생물물리학 기법을 검토하였습니다. 이들은 서로 다른 2가지 셀 라인에 의해 발현된 단일클론 항체 약품(셀 라인 1 및 2)과 생산 공정 변경이 있었던 단일클론 항체 약품(공정 2pA 및 2pB)의 비교 연구에 사용된 생물물리학 특성 분석 도구 중 하나로서 DSC의 활용에 대해 언급했습니다. 생산된 3가지 단백질 제품은 FTIR(2차 구조 측정 목적), near-UV CD 및 고유 형광측정법(3차 구조 비교 목적), ANS 결합(표면 소수성 비교 목적), DLS(단백질의 유체역학적 속성 및 사이즈 분포 비교 목적), DSC(열적 안정성 및 용해도 비교 목적)로 평가되었습니다.
이러한 일단의 생물물리학 분석법의 결과는 3가지 샘플의 전반적인 2차 및 3차 구조가 유사함을 시사하였습니다. DSC 결과는 셀 라인 2pB에 존재하는 단백질의 열적 안정성이 2pA 샘플 및 셀 라인 1 샘플에 비해 크게 증가했음을 알려주었습니다. 또한 DSC에 따르면 2pA 및 셀 라인 1 샘플은 더욱 불균일한 것으로 나타났습니다. 일반적으로는 항체에서 2~3회의 전이가 관찰됩니다(그림 2에서 ‘일반적인’ 항체 DSC 서모그램의 예시 참고). 이러한 시료의 DSC 분석에서 중첩된 열 전이의 수가 많다는 것은 샘플이 불균일하다는 것을 나타냅니다. DSC 결과는 공정 변경으로 관심 대상인 단일클론 항체의 균일성과 안정성이 개선되었음을 시사했습니다. 이 논문에서 논의된 생물물리학적, 생화학적, 기능적 분석 비교 데이터에 기초할 때 셀 라인 2와 공정 2pB는 더욱 안정적인 단백질을 생산하는 것으로 파악되었습니다[21].
Jiang과 Nahri[21]의 두 번째 예시에서는 서로 다른 제조 현장에서 생산된 단백질 제품의 비교성을 조사하기 위해 DSC를 사용했습니다. 단백질 Y는 분자의 Fc 영역을 통해 이황화 결합된 2개의 단량체 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있었습니다. 개발 과정 중에 단백질 Y는 서로 다른 현장에서 제조되었습니다. 서로 다른 로트에 든 단백질이 네이티브 형태, 2차/3차 구조, 열적 안정성, 사이즈 분포, 면에서 비슷함을 검증하기 위해 4개의 서로 다른 단백질 Y 샘플을 FTIR, far-UV CD, near-UV CD, 형광측정법, DSC, AUC를 통해 분석하였습니다. 4개의 샘플 중 3개는 서로 다른 사이트에서 제조된 것이며 1개는 기준 단백질이었습니다.
기준 단백질과 서로 다른 제조 현장의 3개 샘플에 대한 DSC 스캔은 각 샘플마다 2개의 열 전이가 있었음을 보여주었고 4개의 DSC 프로필 모두 실험 편차 내에서 동일했습니다. 이는 단백질 샘플이 열적 안정성에 차이가 없으며 모두 네이티브 형태로 접힌 상태라는 것을 시사했습니다. DSC에서 산출된 결과 등을 결합한 생물물리학적 특성 분석 결과는 4개의 단백질 샘플 모두가 비슷하고 적합한 2차 및 3차 구조를 갖고 있으며 서로 동질적임을 입증하였습니다[21].
DSC 서모그램이 동일하지 않았다면 이는 공정 또는 포뮬레이션과 관련하여 전사 이후 변이에 변화가 있거나 단백질에 화학적 변성이 있었다는 것을 나타낼 수 있습니다. 저자 등[22]은 일반적인 분해 경로인 산화에 의해 발생하는 안정성 측면의 HOS 변화를 검출하는 데 있어 DSC의 감도를 증명했습니다. 정제나 최종 포뮬레이션 보관 중에 바이오 의약품에 산화가 발생할 경우 이것이 효능에 부정적인 영향을 미치는 것은 물론 단백질 응집 형성 확률을 높일 수 있습니다. 이 연구에서는 구조적으로 다른 3가지 종에서 얻은 단백질 제품을 다양한 산화 수준에서 평가했습니다. 각 단백질은 메티오닌 산화의 작용에 따라 TM이 선형적으로 감소함을 보여주었습니다. 또한 저자는 구조 종 사이와 그 내부에서 TM의 변화 속도 차이와 함께 영역 TM 안정성의 차이를 관찰했습니다[22]. 이와 달리 near-UV CD 및 형광 분광법은 산화로 유도된 형태적 변화에 대한 감도가 크게 낮았습니다. 반면 DSC는 이러한 분광학 방법과 비교하여 단백질 산화를 모니터링하는 데 더욱 적절한 구조 특성 분석법입니다[22]. 연구(IgG2B)에서 한 단백질의 경우 상대적 역가의 손실에 앞서 DSC에 의해 TM의 변화가 감지되었으며, 이러한 사실은 DSC가 항원 결합 감소에 있어 주된 지표가 됨을 나타냅니다. 질량분광법(MS)에 의한 감지 가능한 산화메티오닌의 변화는 감지 가능한 형태적/기능적 영향을 나타내는 수준 미만의 산화 수준에서 발생했습니다. DSC의 TM 변화와 MS 및 역가 방법을 함께 이용하면 일차 구조 변이, HOS 및 구조적 안정성의 변화, 기능적 영향 간의 관계를 신뢰성 있게 분석할 수 있습니다.
Morar-Mitrica 등[12]은 관측 가능한 TM 변화를 통한 단일클론 항체 산화의 특성([22]에서 설명한 것과 유사), 재현 가능한 DSC 서모그램 프로필, 바이오 제약의 비교 연구를 위한 TM, T1/2, Tonset, ∆H의 활용, 다양한 수준의 글루코실화를 통한 글루코실화 단일클론 항체의 확장 DSC 특성 분석(일반적인 전사 이후 변이) 등의 HOS 및 바이오 제약 비교 연구에 DSC를 활용한 여러 사례 연구에 대해 설명했습니다.
Shahrokl 등[23]은 DSC의 간편한 사용 방법과 데이터 결과의 단순성을 언급하며 바이오 제제 허가 신청의 일환인 비교 연구에 DSC를 어떻게 활용할 수 있는지에 대해 논의했습니다. 저자는 제조 공정의 변경 전후의 51 kDa 당단백질에 대한 비교 연구에 어떻게 DSC를 활용했는지 기술하고 있습니다. 공정 변경은 제품 산출량을 높이고 세포 배양 배지에서 기원한 동물 유도 물질을 제거하기 위해 실행되었습니다. 저자는 DSC를 활용하여 각 제조 공정을 통해 생산된 3개의 당단백질 로트를 평가해 DSC 서모그램의 구조 중첩(Superimposition)이 가능하며 60.7 °C +/- 0.1 °C에서 단일한 전이를 보인다는 점을 관찰했습니다. DSC 결과는 제조 변경이 당단백질의 형태적 안정성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었습니다[23].
Lubiniecki 등[24]은 제품 개발 과정 중에 2개의 서로 다른 IgG1 단일클론 항체 후보(항체 A 및 항체 B)에 대한 3건의 비교 연구를 통해 항체의 구조 및 기능에 대한 제조 변경의 영향을 평가하였습니다. 2건의 비교 연구는 생화학 및 생물물리학 분석 도구 중 하나로 DSC를 사용했습니다. 1건의 연구는 공정 확장 및 제조 현장 이전과 함께 동결 건조 제형에서 액체 제형으로 변경한 경우에 주목했습니다. 항체 A와 항체 B의 동결 건조 및 액체 포뮬레이션에 대한 DSC 서모그램은 양호한 상관 관계를 보여주었습니다[24]. MS, CD, SEC 및 기타 분석법이 함께 사용된 DSC는 제조 변경이 항체의 구조나 기능에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었습니다.
3번째 비교 연구는 프리필드 주사기 또는 바이알에 든 항체 액체 포뮬레이션을 평가했습니다[24]. DSC, CD, SEC 및 기타 분석법의 결과는 유사한 분자 구조, 생물학적 활성도, 분해 프로필을 시사했습니다. 주목할만한 한 가지 예외 사항은 프리필드 주사기에서 미립자 수준이 작지만 유의미하게 증가했다는 것입니다[24].
바이오 시밀러 제품(“Follow-on biologic” 또는 “Subsequent entry biologic”라고도 함)은 이전에 승인된 생물학적 제품(기준 제품, 모제품 또는 선도 제품)에 대한 높은 유사성에 근거해 규제 기관에서 승인한 바이오 의약품을 말합니다. 바이오 시밀러는 수년 동안 전세계에 판매되었습니다[25-29]. 이 백서가 작성된 시점(2016년 10월)에 미국 FDA는 4개의 바이오 시밀러를 승인했고 EMEA는 19개의 바이오 시밀러를 승인했습니다.
바이오 시밀러의 개발은 저분자 제네릭 약물을 개발하는 것과 다릅니다. 저분자 약물은 화학물질이며 저분자 약물의 합성은 통제된 공정입니다. 바이오 약제는 일반적으로 단백질이기 때문에 생물학적 발현 체계와 제조 공정의 고유한 변동성으로 인해 같은 제품의 다른 배치에도 단백질에 특정 정도의 차이가 있기 마련입니다. 이러한 차이에는 전사 이후 변이 및 HOS의 차이가 포함됩니다. 단백질의 높은 분자량, 복잡한 구조 및 자연적인 변화로 인해 바이오 시밀러는 제네릭 약품을 생산하는 것처럼 단순하지 않습니다. 바이오 시밀러는 기준 제품의 정확한 복제품이 아니기 때문에 일반적으로 기준 제품과 ‘유사’하거나 ‘매우 유사’하다고 표현되는 것입니다.
바이오 시밀러의 개발에는 기준 단백질과 바이오 시밀러에 대한 물리화학적/분석적/기능적 비교가 수반됩니다. 이러한 분석에는 동등한 효능과 안정성을 확인하기 위해 비임상 및 임상 비교 데이터가 보완됩니다. 바이오 시밀러는 승인 전에 안정성과 효과성 측면에서 기준 제품과 유의미한 차이가 없다는 것이 임상에서 검증되어야 합니다. 임상적으로 비활성인 성분에서 작은 차이만 있는 경우 바이오 시밀러 제품으로 허가가 가능합니다. 바이오 시밀러는 승인된 동일 징후에 대해 기준 제품과 정확히 같은 방식으로 작용할 것으로 기대됩니다.
규제 기관은 기준 제품에 대한 유사성 수준에 근거해 바이오 시밀러를 평가합니다. 바이오 약제의 복잡성으로 인해 동일한 숙주 발현계, 공정 및 동등한 기술을 사용한다 해도 서로 다른 2개의 제조업체가 2개의 동일한 제품을 생산할 가능성은 낮습니다. 따라서 바이오 시밀러 생산자는 위에서 논의한 대로 HOS에 대한 비교 연구 및 분석을 활용해야 할 필요가 있습니다[30,31]. 바이오 시밀러 개발에는 더 많은 분석 정보가 필요하고 촉박한 일정이 요구되기 때문에 모든 단계에서, 특히 제조 중에 기준 물질에 대한 유사성 입증이 필수적입니다.
바이오 시밀러는 기준 제품에 최대한 가까이 일치시키기 위해 ‘역엔지니어링’을 수행해야 합니다. 바이오 시밀러에 대한 특성 분석에는 1차 및 고차원 구조(2차, 3차, 4차) 평가, 생물학적 활성도, 제품 및 공정 불순물 분석이 포함됩니다. DSC는 바이오 시밀러가 기준 제품에 대해 매우 유사한 DSC 프로필 ‘지문’과, 유사한 TM, Tonset 및 기타 열역학 매개 변수를 가짐을 입증하기 위한 HOS 생물물리학 분석법으로 사용됩니다.
미국 FDA에서 승인한 4개의 바이오 시밀러 중 다음 3개(2016년 10월 현재)는 FDA 신청 과정에서 HOS 분석법 중 하나로 DSC를 포함하였습니다.
Erelzi(Sandoz, Inc.)는 Amgen 사의 Enbrel(etanercept)에 대한 바이오 시밀러임[32]
다른 시장에서 Remsima로 판매되는 Inflectra(Celltrion)는 Janssen 사의 Remicade(infliximab)에 대한 바이오 시밀러임[33,34]
Amjevita(Amgen)은 Abbvie 사의 Humira(adalimumab)에 대한 바이오 시밀러임[35,36]
Sinha-Datta 등[37]은 열적 안정성, 반응 속도 및 친화도에 근거하여 2가지 치료용 단일클론 항체와 그 바이오 시밀러(mAb1-B 및 mAb2-B1, B2, B3)를 비교하기 위해 분석 도구로서 DSC(MicroCal VP-Capillary DSC)와 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 활용한 것이 유효했음을 입증했습니다. 이들은 SPR 결과에서 얻은 생물학적 기능과 관련하여 바이오 시밀러가 기준 샘플과 매우 유사하다는 것을 관측했습니다. 모제품과 바이오 시밀러 제품 사이의 생물학적 동등성을 확인하기 위한 다른 방법으로 DSC가 사용되었습니다. DSC 분석은 84.1°C(mAb1)와 72.8°C(mAb2)의 1차 TM을 제시하며 모제품 항체와 바이오 시밀러 항체에서 우수한 구조적 유사성을 보여주었습니다.
본 백서에 제시된 정보는 바이오 약제 비교 및 생물학적 동등성 분석에 있어 생물물리학적 안정성 및 HOS 분석법으로서 DSC를 활용하는 것의 중요성과 가치를 입증하고 있습니다. 바이오 제약 기업은 DSC의 결과와 다른 생물물리학 및 생화학 분석법을 함께 사용하여 단백질의 안정성 및 비교성에 대해 정보에 기반한 의사결정을 내릴 수 있고, 각각의 단백질 배치가 기준 로트와 매우 유사하며 공정 또는 제조 변경이 형태적 단백질 안정성에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있습니다. DSC는 또한 바이오 시밀러가 선도 제품과 ‘매우 유사’하다는 것을 입증하기 위해 바이오 시밀러 개발을 위한 HOS 분석법에도 포함됩니다.
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