치료 후보 단백질의 안정성은 개발의 성패에 있어 결정적입니다. 단백질의 안정성은 생산, 제조, 포뮬레이션, 장기 보관, 환자에 대한 전달 및 효능에 영향을 미칩니다. 안정성이 높은 단백질은 제조 중에 문제 발생 빈도가 더 낮고, 생산하기에 더욱 경제적이며, 포뮬레이션 및 보관 중에 기능을 유지할 확률이 높습니다. 바이오 제약 개발에 대한 "설계에 의한 품질”(Quality by Design, QbD) 접근법에서 안정성 특성 분석은 후보 분자의 "개발 가능성" 또는 "약물화 가능성"을 초기에 평가하는 데 활용되며 공정 개발 및 제조 중에 지속적으로 재평가됩니다. 안정성 데이터는 또한 제조 지원, 바이오 제약 비교성 및 생물학적 동등성에 사용되는 고차원 구조(HOS) 특성 분석 및 "지문 분석"에도 활용됩니다. 단백질 HOS 특성 분석은 바이오 제약 분야의 새로운 신약과 바이오 시밀러에 대한 규제 제출물에 있어 표준적인 내용이 되고 있습니다.
단백질의 복잡한 속성으로 인해 생물물리학적 특성 분석 도구는 바이오 제약 제품의 분석에 있어 중요합니다. 원이색법(CD), 동적 및 정적 광산란(DLS 및 SLS), 크기 배제 크로마토그래피 다각도 광산란(SEC-MALS), 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR), 분석적 한외 여과(AUC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 시차 주사 형광측정법(DSF), 고유 형광측정법(IF) 및 시차 주사 열량측정법(DSC)와 같이 단백질 안정성을 평가하는 데 흔히 사용되는 생물물리학적 도구는 다양합니다.
이러한 기술은 모두 바이오 제약 개발에 있어 중요한 역할을 하며 DSC에 의한 열적 안정성의 특성 분석은 필수적입니다. 단일클론 항체 고차원 구조 특성 분석에 사용되는 생물물리학 기술에 대한 2015년 논문, Gokarn 외 언급: "DSC는 주어진 완충액 조건에서 단백질의 안정성을 평가하기 위한 최고의 기법으로 유지되고 있음”[1].
이 백서는 단백질이 우선적으로 네이티브(접힌) 형태인 용액 조건을 선택하기 위해, 그리고 안정적이고 효과적인 약품을 생산하기 위해 DSC를 사용하여 프리포뮬레이션 및 포뮬레이션 개발 중에 단백질 바이오 약제의 열적 안정성을 분석하는 데 중점을 두고 있습니다.
DSC는 미세 열량측정 기법으로서 단백질, 핵산, 지질 및 기타 바이오 고분자의 열적, 구조적 안정성을 분석하는 데 사용됩니다[2-7]. DSC는 온도의 함수로서 열용량을 측정합니다. 본 백서에 설명된 단백질 특성 분석에 사용되는 DSC 장비는 '배율 보상(power compensation)' 장비로서 완충액 내에 바이오 고분자가 포함된 고정식 샘플 셀과, 동일한 완충액으로 채운 대응되는 기준 셀을 사용합니다. 샘플 셀에서 얻은 열 용량(Cp) 신호는 기준 셀의 신호와 비교됩니다. 셀의 온도가 증가함에 따라 기준 셀과 샘플 셀 사이의 온도 차이가 지속적으로 측정되고 배율 단위로 보정됩니다. DSC는 단백질을 증가하는 온도에 노출시켜 단백질의 풀림이 시작되면 그에 따라 단백질의 Cp가 증가하기 때문에 '강제 분해 분석법'으로 알려져 있습니다(그림 1).
그림 1: DSC의 작동 방식: 단백질의 열적 변성에 따른 열용량(Cp) 변화 DSC 실험은 단백질이 주로 네이티브 형태에서 접힌 상태인 온도에서 시작합니다. 온도가 증가함에 따라 어느 순간 단백질의 풀림/변성(Tonset)이 시작되고 Cp가 증가합니다. 단백질 중 50%가 네이티브 형태이고 50%가 변성되는 온도에서 Cp는 최대값에 도달합니다. 이를 열전이 중간점 또는 TM이라 합니다. TM 이상에서는 단백질이 주로 변성된 상태이며 DSC 실험의 말미에는 모든 단백질이 풀린 형태가 됩니다. DSC의 실험 변수에는 Tonset, TM, 풀림 엔탈피(ΔH)가 있습니다.
DSC는 형광 물질이나 기타 표지 또는 프로브 없이 열용량 변화를 직접 측정합니다. 가역적으로 변성되는 단백질의 경우 용융 또는 변성 온도라고도 하는 열전이 중간점(TM)은 단백질이 50%는 네이티브(접힘) 형태이고 50%는 변성된 형태인 구조적 평형을 이루는 온도입니다. TM은 DSC 서모그램의 "피크"로 측정합니다.
TM은 우수한 열적 안정성 지표로 여겨집니다. 즉, TM이 높을수록 단백질이 열적으로 더욱 안정적인 것입니다. 여러 영역 단백질(항체 등)은 일반적으로 DSC 서모그램에서 하나 이상의 피크를 가지므로 하나 이상의 TM을 측정할 수 있습니다(예시로 그림 2 참고).
그림 2: CH2, Fab, CH3 영역을 식별한 단일클론 항체의 대표적 DSC 서모그램. 빨간색 점선은 각 영역 전이의 디콘볼루션 피크로 3개의 TM이 표시되어 있습니다.
DSC는 단백질 안정성의 특성을 분석하고 순위를 결정하는 데 사용할 수 있는 풀림 엔탈피(ΔH, 곡선 아래의 면적으로 측정)와 같은 다른 유용한 매개 변수를 제공합니다. 단백질 풀림은 단백질을 접힌 상태로 정확히 유지하는 2차 비공유 결합을 파괴하는 데 에너지 입력이 필요하기 때문에 흡열 과정입니다. DSC는 또한 Tonset(풀림 시작), ΔCp(풀림의 열용량 변화), T1/2(1/2 피크 높이에서의 너비, 풀림 서모그램의 형태를 나타냄)도 측정합니다. DSC 분석에는 이러한 매개 변수 조합에 대한 측정을 포함할 수 있습니다.
대부분의 단백질 변성은 비가역적이고 가열 시 응집하거나 침전하는 경향이 있습니다. 비가역적 변성 단백질의 DSC 분석에서 얻은 TM 및 기타 매개 변수는 진정한 열역학 매개 변수가 아닙니다. 그러나 비가역적 단백질 변성에 대한 DSC 분석에서 얻은 TM의 순위는 안정성 선별을 위해 아주 유용한 정량적 매개 변수입니다.
Malvern Instruments는 용액 내 단백질 및 바이오 고분자에 대한 TM 선별 및 열역학적 특성 분석을 위해 설계된 자동 시차 주사 열량측정계인 MicroCal VP-Capillary DSC 시스템[8,9]을 제공합니다.
그림 3. 바이오 제약 발견 및 개발 과정의 일반적인 체계
그림 3은 바이오 제약 발견 및 개발 파이프라인의 일반화된 체계를 보여주고 있습니다. 녹색 부분은 안정성 분석 등의 생물물리학 특성 분석이 가장 흔하게 이용되는 부분을 강조한 것입니다(더 나아가 본 백서의 끝에 바이오 제약의 발견 및 개발에 대한 "권장 읽을거리" 목록이 있음).
폴리펩티드 사슬을 형성하는 아미노산 배열은 단백질의 일차(1°) 구조로 불립니다. 이외에 3개의 추가적인 고차원 구조(HOS) 수준이 있으며, 이는 안정성, 기능성, 활동성 및 전반적인 단백질 특성을 완전히 이해하기 위한 분석에 있어 중요합니다. 단백질 2차(2°) 구조는 α-나선, β-면, 회전형 및 불규칙 나사선 등 단백질 1차 구조의 국부적인 접힘 구조를 말합니다. 3차(3°) 구조는 2차 구조 요소의 배열에서 발생하는 단백질의 최종적인 3차원 구조를 말합니다. 마지막으로 4차(4°) 구조는 2개 이상의 동일하거나 서로 다른 폴리펩티드 사슬의 상호 작용으로 인한 결과를 설명합니다.
바이오 치료제를 위한 가장 보편적인 투여 수단은 피하(SC) 경로를 통해서 입니다. SC로 전달된 단백질 약물은 안정적이며 적합한 용기(예: 바이알 또는 프리필드 주사기)에 밀봉해 놓으면 아주 높은 단백질 농도(100mg/mL 이상)인 경우에도 일반적으로 수년 동안 영향을 받지 않습니다. 과학자들은 이를 염두에 두고 원하는 바이오 약제를 만들기 위해 처음에 후보 물질을 선정할 때 이미 높은 안정성이 입증된 바이오 분자를 모색합니다. 그러나 개발 및 제조 공정 전반에는 분자의 안정성에 영향을 미치는 다양한 요소가 있으며, 이는 단백질 엔지니어링을 통해 안정성 증가 필요할 수 있다는 점을 의미합니다.
정제 공정에는 안정적이고, 정확히 접혀 있고 활성인 상태에서 단백질을 제거하는 과정이 수반되므로 완충액, 첨가제, 정제 방법 및 보관 조건을 신중하게 조정하여 이러한 지점에서 단백질을 가능한 한 안정적으로 유지하는 것이 중요합니다. 단백질 분자가 바이오 제약 포뮬레이션 및 생산 전반에서 빈번히 발생하는 열, 화학물질, pH 변화, 압력, 혼합, 고농도와 같은 스트레스 요인에 노출되면 구조가 변성된(풀린) 형태가 되기 쉽습니다.
용액 내 단백질도 변성된 비활성 단백질로 이어질 수 있는 탈아미드화 및 산화와 같은 수정에 영향을 받기 쉽습니다. 단백질 바이오 약제의 경우 변성 또는 기타 수정으로 인해 응집물이 형성되어 제품의 효능이 감소하거나 약물로서 기능을 상실하게 될 수 있습니다. 더욱 중요한 점은 점점 더 많은 증거들이, 단백질 응집이 환자에게 잠재적으로 치명적인 원치 않는 면역원성 반응을 형성하는 데 기여할 수 있다는 점을 지적하고 있다는 것입니다. 본질적으로 안정된 단백질을 사용하면 생산의 경제성이 높아지고 성공적이고 효과적이고 안전한 약품을 만들 수 있습니다.
DSC는 열적으로 변성될 때 발생하는 3차 및 4차 구조의 구조적 안정성 및 변화에 대한 상세한 개요는 물론 내재적, 외부적 요인이 단백질 안정성에 미치는 영향에 대한 정보를 제공합니다. DSC는 바이오 제약 단백질의 열적 안정성 분석을 위해 가장 정량적인 최고의 분석법으로 여겨지고 있으며 장기 안정성의 예측 인자로 종종 사용됩니다.[1,10-14]. DSC를 통해 생성된 TM은 후보 물질 선정(개발 가능성), 포뮬레이션 선별 및 공정 개발 중에 안정성의 순위를 결정하는 데 자주 사용되는 변수입니다. DSC에서 얻은 엔탈피(ΔH), Tonset, T1/2, ΔCp는 안정성 순위 결정, DSC 데이터 검증, 단백질 풀림의 정량 분석, 고차원 구조 '지문 분석'에도 사용됩니다.Tm[10-14].
정의된 용액 조건에서 매우 유사한 단백질에 대한 DSC 분석은 재현성이 높고 정량적입니다(그림 4). 즉, DSC 서모그램이 유사한 프로필을 가지며 매개 변수(TM, ΔH 및 Tonset 등)가 허용 범위 내에 있게 됩니다[12-14]. 서모그램이 다르게 나타나고 DSC 피팅 매개 변수가 변하는 경우 이는 단백질 잘못 접힘, 분해, 응집, 완충액의 차이, 전사 이후 변이의 변화와 같은 사건이 있었거나 기타 고차원 구조 변화가 발생하여 단백질의 구조적 안정성에 영향을 미쳤다는 것을 의미합니다.
그림 4: PBS의 소 혈청 알부민에 대한 19개 DSC 서모그램(Sigma A1933, 크로마토그래피 방식으로 정제). 주사 속도 정규화, 완충액 대 완충액 제거, 통합 및 기준선 제거 후 표시된 DSC 데이터. Tonset, TM1, TM2의 평균과 표준편차가 표시되어 있습니다.
DSC는 재현 가능하고 정량적인 결과를 제공하기 때문에 제조 중 제품 평가(배치 대 배치 및 현장 대 현장 비교 등), 단백질 변이형 및 수정 제품의 비교(글리코실화, 탈아미드화, 산화 등), 생물학적 동등성을 위한 귀중한 HOS 특성 분석 도구입니다. DSC 데이터는 또한 신약 및 바이오 시밀러 관련 제출물에서 HOS 특성 분석의 일부로서 규제 근거 문서로도 사용됩니다. 바이오 제약 과학자에 대한 설문조사에서 DSC는 후보 물질 선정, 포뮬레이션 개발, 제품 특성 분석, 비교성, 생물학적 동등성 연구를 수행할 때 '아주 유용한' 또는 '몹시 유용한' 생물물리학 분석 기법으로 평가되었습니다[15].
TM 값은 복잡한 데이터 분석 없이 DSC 서모그램 피크에서 아주 간단히 측정할 수 있습니다. 이전에 보았던 대로(그림 2) 항체와 같은 여러 영역 단백질의 경우 DSC 서모그램은 하나 이상의 풀림 전이를 보여줍니다. DSC는 여러 영역을 분석하고 정량화할 수 있으며 두세 개 이상의 전이에 대해 TM을 측정할 수 있습니다. TM을 측정할 수 있는 CD, IF, DSF와 같은 기타 생물물리학 분석법은 가장 낮은 온도에서 발생하는 첫 번째 TM만 검출할 수 있거나 여러 영역 단백질에서 가장 '주된' TM만 검출할 수 있습니다. 분광법 또는 형광 데이터에서 하나 이상의 TM을 추출하려면 복잡한 데이터 피팅이 요구되며 재현이 불가능할 수 있습니다.
다른 TM 선별 분석법과 비교하여 DSC는 종종 더 많은 주사당 단백질 샘플이 필요하며 처리량이 낮을 수 있습니다. 샘플이 제한된 경우 한가지 옵션은 DSF 또는 IF로 초기 TM 순위 분석을 수행한 다음 몇 개의 주요 샘플을 선택해 DSC로 TM을 검증하는 것입니다. 중요한 점은 안정성 분석에서 TM의 측정을 위해 형광측정법 또는 분광법만을 이용하는 것이 아니라 이러한 DSC 검증 단계를 수행한다는 것입니다. 형광 기반 분석법에서는 종종 측정을 방해하는 아티팩트(artifact) 때문에 TM의 결과가 더 높거나 낮은 값으로 이동합니다. 또한 일부 단백질 및 완충액 조건은 형광측정법과 호환되지 않으므로 DSF나 IF가 적합하지 않습니다. 결론적으로 형광측정법과 분광법은 DSC가 제공하는 열량 측정 엔탈피와 기타 열역학 매개 변수를 측정할 수 없습니다.
DSC는 다음과 같은 이유로 바이오 제약 산업의 연구자들에게 '절대적 표준'의 열적 안정성 분석법으로 여겨지고 있습니다.
단백질 풀림과 관련한 열 변화를 측정합니다.
단백질 풀림을 직접 측정하므로 표지, 프로브 또는 태그가 필요하지 않습니다(따라서 DSC는 형광측정법이나 기타 분광법에서 흔히 발생하는 단백질 검출 아티팩트의 영향을 받지 않음).
용액 안의 네이티브 단백질에 적용할 수 있습니다.
바이오 제약 분야의 정제 및 포뮬레이션에 일반적으로 사용되는 거의 모든 완충액 및 첨가제를 사용할 수 있습니다. 이와 달리 형광측정법과 분광법에서는 이러한 여러 완충액과 첨가제가 호환되지 않습니다.
설정과 작동이 쉽습니다.
정밀한 온도 제어가 가능하고 작동 범위가 최대 130°C에 달하기 때문에 대부분의 고온 TM 전이를 검출할 수 있습니다. 대부분의 다른 TM 선별 분석법은 시료를 100°C(또는 그 이하)까지만 가열합니다.
'강제 분해' 분석법으로서 분석 전에 가열된 완충액에 단백질을 보관할 필요가 없습니다.
간편한 데이터 출력 및 통합 데이터 분석 소프트웨어를 갖추고 있습니다.
분리된 풀림 전이를 확인하고 여러 영역 단백질, 단백질 복합체는 물론 간단한 단일 영역 단백질을 분석할 수 있습니다.
풍부한 정보를 제공하며 열역학 데이터와 더불어 구조적 안정성 및 TM 측정 데이터를 제공합니다.
바이오 치료제의 열적 안정성 분석을 위한 기본 분석법으로 사용할 수 있으며, 기타 직교법/보완적 생물물리학 선별 도구와 함께 사용하거나 다른 데이터를 검증할 수 있습니다.
열적 안정성의 신속한 선별을 위해 높은 처리량을 제공하는 자동 시스템 (MicroCal VP-Capillary DSC 시스템)을 이용할 수 있습니다.
단백질 기반 약물은 발견에서 개발에 이르는 파이프라인을 거치기 때문에 출하, 사용 및 원하는 전체 보관 수명 기간 중에 안정성, 구조, 효능을 유지하는 적절하고 효과적인 최적의 포뮬레이션을 개발하는 것이 중요합니다. 포뮬레이션은 경제적으로 제조할 수 있어야 합니다. 환자의 편의를 위해 자체 투여가 가능한 단백질 포뮬레이션이 좋으며, 약품은 의료 전문가의 도움이 필요하지 않은 프리필드 주사기 또는 유사 전달 시스템에 저장되어 출하되어야 합니다. 또한 약품은 냉장고 등에서 적절한 온도로 보관해야 합니다. 일부 바이오 약제는 동결 건조된 상태로 출하될 수 있으며 이러한 약제는 투여 전에 약물을 용해해야 합니다.
개발 주기의 초기에는 종종 테스트에 사용할 수 있는 샘플 용량이 제한되기 때문에 일부 기업들은 단백질 안정화를 돕기 위해 초기에 소규모 생물물리학 연구를 수행하여 최적의 완충액 조성과 pH를 정의하는 프리포뮬레이션 개발을 수행합니다. 이러한 작업은 궁극적으로 단백질 약물을 전임상 및 임상 시험에 사용하게 될 포뮬레이션을 확립하는 데 도움이 됩니다. 프리포뮬레이션 개발은 약물 개발 가능성 평가를 위한 후보 물질 선정과 동시에 수행할 수 있습니다. 두 평가 절차 모두 다수의 동일한 생물물리학 테스트를 포함하기 때문입니다.
단백질 약물의 프리포뮬레이션과 후속되는 포뮬레이션 개발 중에 단백질은 다음과 같은 여러 가지 조건에 노출됩니다.
서로 다른 완충액, pH 수준, 염도
서로 다른 포뮬레이션의 첨가제(부형제). 부형제는 액체나 동결 건조된 제형에 포함되어 단백질의 안정화를 돕고 제조 또는 약물 전달에 도움을 주는 불활성 물질입니다. 바이오 제약 제품에 흔히 사용되는 부형제에는 계면활성제(폴리소르베이트 80 등), 당류(트레할로오스), 폴리올(글리세롤 등), 아미노산, 방부제 및 산화방지제가 있습니다.
높은 단백질 농도. 단백질 응집이 발생하기 전에 후보 약물을 다양한 완충액과 첨가제에서 농축할 수 있는 수준을 측정하기 위한 목적
극한의 온도, 압력 및 습도
반복되는 동결/해빙 주기 및 섞임(예: 공기/액체 계면, 운반 스트레스)
최종 용기 마개(바이알, 사전 충전 주사기, IV 백) 등 다양한 물질 표면과의 접촉
여러 수준의 빛
산화제
실시간 보관 테스트(일반적인 년의 보관 수명 전체에 걸쳐 의도한 보관 조건에 약품을 유지하여 약품의 장기 안정성 잠재력을 평가하기 위한 목적) 및 온도 상승 시 가속 스트레스 연구
2016년의 한 논문(Kang 외[16])은 시판 중인 단일클론 항체에 성공적으로 사용되고 있는 37개 포뮬레이션을 평가했습니다. 주요 평가 요약:
12개는 동결 건조, 25개는 액상 포뮬레이션(농도 범위는 2mg/mL ~ 200mg/mL)
포함된 부형제: 염분, 계면활성제, 올리올, 이당류, 다당류, 아미노산 및 산화방지제
아세트산염, 구연산, 히스티딘, 인산염 및 트리스 완충액을 공통적으로 사용하여 4.7 ~ 7.4 사이에서 최적의 pH 유지
대부분의 포뮬레이션이 가장 보편적인 계면활성제 3개 중 1개를 사용함: 폴리소르베이트 80 (Tween 80), 폴리소르베이트 20 (Tween 20) 폴록사머 188
모든 동결 건조 제형에 당류(폴리올/이당류/다당류)가 포함된 반면 액상 포뮬레이션은 30%가 당류 포함
NaCl을 공통적으로 사용
글리신 및 아르기닌은 공통적으로 사용된 아미노산 부형제였음
수용액의 단백질은 네이티브(접힌) 형태 및 변성된(풀린) 형태 간에 균형을 이루고 있습니다. 소수성 상호 작용 및 수소 결합은 단백질의 주요한 안정화 요소이고 분자가 풀리고 변성되는 문제를 극복할 수 있어야 합니다. 구조적 엔트로피는 안정화시키는 힘을 약화시켜 생체 고분자가 풀리게 합니다. 포뮬레이션 개발에서 주요 목표는 최고 수준의 안정성을 제공하여 네이티브 단백질의 비율을 가장 높게 유지시켜 주는 용액 조건을 찾는 것입니다. 변성된 단백질은 단백질 가수 분해, 산화 및 탈아미드화와 같은 비가역성 화학 공정에 더 민감한 경향이 있고 이 경우 불활화와 응집이 발생할 수 있습니다.
생물물리학 특성 분석 도구는 단백질 형태를 모니터링하고, 열적 안정성을 예측하고, 포뮬레이션 및 보관 조건에 따른 응집 형성을 측정하는 데 사용됩니다. 본 백서의 앞부분에서 논의한 다수의 생물물리학 도구는 프리포뮬레이션 및 포뮬레이션 개발 작업 흐름에 포함됩니다. 이러한 도구에는 DSC, DSF, DLS, SLS, CD, IF가 있습니다. 이러한 분석법은 단백질 형태 안정성(TM 측정, Tonset, DSC 서모그램 프로필을 통해), HOS, 입자 크기 및 응집 형성을 평가합니다.
DSC를 통한 TM 순위 분석은 포뮬레이션 pH, 완충액 및 부형제의 초기 선별에 공통적으로 사용됩니다. 일반적으로 측정된 TM이 높을수록 포뮬레이션의 단백질이 더 안정적이며(그림 5에서 단백질에 대한 pH 선별 중 DSC 서모그램 참조) 보관 중에 응집이 형성될 가능성이 낮습니다(아래의 사례 연구 참조). DSC는 바이오 제약 포뮬레이션에 사용되는 거의 모든 완충액과 부형제와 호환됩니다. 단백질의 열 전이가 본질적으로 비가역적인 경우에도 DSC는 포뮬레이션 개발 전반에서 단백질 안정성에 대한 완충액 조건 및 부형제의 영향을 순위 분석하기 위한 편리하고 빠른 방법입니다.
Figure 5 여러 pH 값의 키모트립시노겐에 대한 DSC 서모그램(각 pH마다 TM 표시).
MicroCal VP-Capillary DSC 시스템은 바이오 제약 산업의 구조적 안정성 분석 및 포뮬레이션 개발을 위해 상당수의 유명 CMO 및 CDMO에 사용되고 있습니다. 이러한 회사에는 Patheon[16], Fujufilm Diosynth Biotechnologies[17], KBI Biopharma[18]가 있습니다.
가속 안정성 연구(또는 '스트레스 테스트')는 포뮬레이션 선별의 공통적인 요소로서, 다양한 잠재적 포뮬레이션과 상승된 온도에서 후보 분자를 저장하고 SEC, DSC DLS를 통해 긴 시간에 걸쳐 구조적 안정성, 크기, 응집, 잠재적인 전사 이후 수정을 평가하는 과정을 수반합니다.
후보 바이오 약제가 개발 파이프라인을 따라 계속 이동해 충분한 양의 단백질을 이용할 수 있게 되면 특성 분석의 주안점이 최종 포뮬레이션 및 생산에 수반되는 공정과 단백질 농도 및 전달 장치의 잠재적인 영향으로 바뀝니다. 선택한 포뮬레이션에서 단백질 약물이 원하는 보관 수명과 안정성을 가지는지 입증하기 위해 장기 안정성 연구도 수행됩니다. 우수한 포뮬레이션은 2년 이상 바이오 약제의 HOS 프로필을 유지합니다.
열적 안정성이 항상 보관 중인 단백질의 물리적 안정성과 상관 관계를 갖는다고 절대적으로 보장할 수는 없지만 TM이 높다는 것은 일반적으로 단백질의 풀림을 유발하는 데 더 큰 에너지가 필요하다는 것을 나타냅니다. 단백질의 다른 모든 속성이 비슷하다면 열적 안정성이 뛰어난 단백질 포뮬레이션이 더 바람직합니다.
1998년의 한 간행물(Remmele 외[19])에서는 MicroCal DSC를 사용하여 여러 부형제가 포함된 완충액에 든 재조합형 인체 인터루킨-1 수용체 1형(IL-1R)의 열적 안정성을 분석하였습니다. pH 3-9의 용액에 보관된 IL-1R을 사용한 가속 안정성 연구(30°C 및 50°C)는 pH 6에서 최소한의 단백질 파괴 및 응집을 보여주었습니다(SDS-PAGE로 검사). '대조' 용액의 IL-1R에 대한 DSC 서모그램은 48°C에서 첫 번째 TM을, 65.5°C에서 두 번째 TM을 나타냈습니다. 당류(마니톨,락토오스, 수크로오스, 클루코오스), 폴리올(폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 에탄올), 계면활성제(Tween 80, Pluronic F68), 염분(NaCl 및 CaCl2), 아미노산(라이신, 시스테인, 알라닌, 글리신) 등 23개의 다양한 부형제가 테스트되었습니다. 두 번째 TM은 부형제의 영향을 받지 않았으므로 안정성에 대한 순위 분석에 첫 번째 열 전이의 온도가 사용되었습니다. 이 전략은 낮은 온도 전이의 TM을 상승시키는 부형제를 찾으려는 것인데, 네이티브 단백질의 안정성이 분명하게 변화된 것으로 나타났습니다. 테스트된 부형제 대부분은 TM이 하향 이동(IL-1R의 불안정화를 의미)하거나 약간 상승 이동하였습니다. TM의 큰 상향 이동(구조적 안정성의 개선을 의미)을 일으킨 첨가제는 100mM NaCl로, 첫 번째 TM을 48.1°C에서 53.1 °C로 높였습니다. 저자는 NaCl 농도를 100mM에서 1500mM로 늘려 시도했고 계속해서 TM 증가가 관찰되었습니다. 이러한 결과는 NaCl이 있는 IL-1R의 열적 안정성 상승이 NaCl과 단백질의 직접적인 상호 작용에 기인한 것임을 말해주었습니다(수분 구조의 변화에 기인할 가능성도 있음). 100mM NaCl이 있는 상태에서 추가적인 부형제 분석이 수행되었습니다.
이러한 동일한 연구에서 저자는 방부제가 IL-1R의 안정성 및 응집에 미치는 영향을 관찰했습니다. 방부제는 다회 투여 포뮬레이션에 포함됩니다. 벤질 알코올, m-크레졸, 페놀을 사용했을 때 DSC 서모그램은 세 가지 방부제 모두 IL-1R을 불안정화시킨다는 점을 보여주었습니다. 이때 페놀은 열적 안정성에 대한 영향이 가장 낮았고 벤질 알코올은 TM에 대한 불안정화 효과가 가장 켰습니다. 이러한 결과는 37°C에서 7일 및 60일 동안 보관한 후 응집 형성에 대한 SEC 분석을 수행하여 검증되었습니다. 페놀을 포함한 샘플은 가장 낮은 수준의 응집을 보인 반면 벤질 알코올에 배양된 샘플은 가장 높은 수준의 응집을 보였습니다.
Remmele 및 Gombotz[20]의 연구는 DSC에 의한 TM 측정이 CD40L 응집의 좋은 예측 인자임을 보여주었습니다. DSC를 통한 pH 안정성 선별을 수행한 결과 가장 높은 TM은 pH 6 ~ pH 7.5 사이에서 측정되었으며, SEC로 측정했을 때 가장 낮은 비율의 응집 형성을 보인 pH 범위와 상관관계가 있음을 나타냈습니다(37°C에서 7일 보관 후).
Remmele[11]은 DSC 서모그램의 데이터를 사용한 다른 연구를 요약하여 다양한 포뮬레이션에서 단백질(키모트립시노겐 및 펩시노겐 등) 안정성을 예측하고 순위를 분석했습니다. Remmele은 또한 DSC와 다른 분석 기법(SEC-HPLC, CD, AUC, DLS, MS)을 함께 사용하여 바이오 약제의 구조적 안정성을 분석할 수 있는 방법에 대해서도 논의하였습니다. 이러한 정보는 어떠한 포뮬레이션을 계속 진행할지 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
다른 포뮬레이션 선별 연구들도 가속 안정성 연구 및 SEC-HPLC[21-25]로 연구했을 때 높은 TM 값(DSC로 측정했을 때)을 가진 포뮬레이션이 낮은 응집 수준을 보여주는 경향이 있다는 데 동의하고 있습니다.
Burton 등[26]은 2개 모델의 재조합 항체를 평가하기 위한 신속한 선별 도구로서 DSC의 활용성을 평가했습니다. TM의 변화는 pH 및/또는 부형제의 작용에 따라 모니터링되었고 결과는 SEC로 분석한 샘플의 가속 안정성 데이터와 비교되었습니다. MicroCal DSC에서 산출한 데이터는 SEC의 데이터와 상관 관계를 보였고(DSC로 측정했을 때 TM 값이 더 높은 샘플이 SEC로 측정한 응집 수준이 가장 낮음) 이에 따라 DSC는 용액 안정성에 대한 최적의 용액 pH 및 부형제 효과를 모두 측정할 수 있었습니다. DSC에 의해 최대 안정성 값이 예측된 pH 값은 단백질 I의 경우 pH 7.5, 단백질 II의 경우 pH 6이었습니다. 이러한 값은 각 단백질에 대한 장기 용액 안정성 연구의 예측 결과와 잘 들어맞았습니다. 논문의 결론에서 저자는, "이러한 연구의 결과는 특히 대량 공급이 종종 매우 제한되는 초기 단계의 단백질 분석 및 제재 개발에 있어 미세 열량측정법이 용액 내 단백질 안정성에 대한 신속한 검사를 위한 가치 있는 도구일 수 있다는 것을 보여준다...이는 약물 요구 사항뿐만 아니라 샘플 준비와 복잡한 분석에 소비되는 시간과 노력 측면에서 상당한 자원 절약으로 이어진다".[26]라고 밝히고 있습니다.
한 Malvern 응용 노트는 Katherine Bowers 박사(Fujifilm Diosynth Biotechnologies)가 프리포뮬레이션 개발에 DSC를 활용한 사례에 대해 자세히 설명하고 있습니다[27]. 이 사례에서는 항체 X를 pH 3 ~ pH 8의 다양한 완충액에 넣고 MicroCal VP-Capillary DSC를 사용하여 즉시, 그리고 1주일 보관 후 DSC 분석을 수행하였습니다.
그림 6: 프리포뮬레이션 완충액 내 항체 X의 TM 값 범위 시료는 T = 0에서 MicroCal VP-Capillary DSC로 분석했습니다.
그림 7: T = 0에서 항체 X의 DSC 서모그램 (A)는 pH 6.0인 호박산염 완충액에 용해되었고 (B)는 pH 3.0인 구연산염 완충액에 용해되었습니다. TM 및 T½ 값이 각각 표시되어 있습니다.
그림 6은 초기 프리포뮬레이션 선별에서 T=0에서의 주된 TM 피크 값을, 그림 7은 pH 3의 호박산염 완충액, pH 6의 구연산염 완충액에 포함된 항체 X의 서모그램을 보여주고 있습니다. 측정된 TM 값 중에서 가장 안정적인 완충액 조건(가장 높은 TM)은 pH 5.0 ~ pH 7.5에서 발견되었습니다. T = 0에서 다른 분석 방법(UV, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 광 산란, 및 SDS-PAGE)은 DSC에 비해 완충액 조건에 대한 식별력이 훨씬 떨어지는 것으로 나타났습니다(여기서는 데이터가 표시되지 않음).
그림 8: T = 0주 및 T = 1주에서 프리포뮬레이션 완충액의 항체 X에 대한 주요 TM 전이의 T½ 값 범위.
그림 8에 표시된 포뮬레이션 조건을 구별하기 위해 T½ 값을 사용했습니다. T½는 DSC 서모그램에 있는 주요 전이의 최대 절반 높이에 대한 피크 폭이고 열 전이의 협동성을 반영합니다. 낮은 T½ 값은 작은 구조를 나타내고 포뮬레이션과 관련하여 선호됩니다. 여기서 1주일 보관 후 최저 T½ 값은 PH 5.5 ~ 6.5인 완충액에서 발견되었습니다(그림 8). 이러한 데이터는 탐색 조건의 수를 상당히 줄이면서 후속 부형제 선별에 적절한 완충액 및 pH 간격에 대한 순위를 매기는 데에 사용했습니다. 이 연구는 DSC를 사용하여 프리포뮬레이션 개발에 대한 pH 및 완충액 조건을 신속하게 최적화할 수 있음을 보여 줍니다.
바이오 약품도 다양한 완충액과 부형제에서 특성을 분석하여 잠재적인 단백질 분해 경로를 파악할 수 있습니다. 이러한 정보는 최종 포뮬레이션을 개발하는 데 도움을 줍니다. 일반적으로 바이오 약제는 포뮬레이션 개발 중에 냉장고에서 보관했을 때 분해되지 않으므로 위의 몇 가지 예시에서 논의했던 것처럼 대개 온도 스트레스 가속 안정성 연구가 수행됩니다. 한 연구(Zheng 외[28])에서는 IgG1 치료용 단일클론 항체 mAb-A의 분해를 조사했습니다. 이 그룹은 먼저 MicroCal VP-Capillary DSC를 사용하여 서로 다른 완충액(인산나트륨, 구연산나트륨, 아세트산나트륨), 서로 다른 농도(20mM 및 100mM), 서로 다른 pH 값(pH 4.5, 5.5, 6.5, 7.5)에서 mAb-A를 평가하였습니다. 각 완충액 그룹 중에서 최고 TM 및 Tonset 값에 기반한 가장 유망한 포뮬레이션 후보가 추가 평가(인산나트륨 pH 6.5 + 20mM NaCl, 구연산나트륨 pH 6.5 + 20mM NaCl, 아세트산나트륨 pH 6.5 + 20mM NaCl)를 위해 선택되었습니다. 이러한 3가지 완충액에 든 mAb-A는 유사한 TM 및 Tonset를 보여주었을 뿐만 아니라 DSC 서모그램 프로필도 거의 동일했습니다. 이 연구는 또한 비교로서 아세트산나트륨 pH 4.5 + 20mM NaCl에서 포뮬레이션을 조사하여 낮은 열 전이 및 TM을 얻었습니다.
저자는 40°C에서 4개의 포뮬레이션에 mAb-A를 보관하여 SEC(네이티브 단백질에서 분해 산물을 분리하기 위해), DLS(수정된 제2 비리얼 계수를 측정하여 단백질간 상호 작용을 분석하기 위해), LC-MS(분해 산물의 순서를 측정하기 위해), 소수성 상호 작용 크로마토그래피(네이티브 단백질에서 분해 산물을 분리하기 위해), SDS-PAGE(분해 산물의 분자량을 측정하기 위해)로 단백질을 추가로 분석하였습니다. 그 결과 pH 6.5의 동일한 완충액에서 보관한 경우와 비교해 pH 4.5의 완충액에서 보관했을 때 단편화가 더 많이 유발되었습니다. 또한 pH 4.5에서 보관했을 때 CH2 영역의 풀림이 유도되고 mAb-A의 표면 접근성이 증가해 단편화가 촉진되었습니다. DSC는 pH 6.5의 인산 완충액, pH 6.5의 아세트산 완충액에서 mAb-A의 형태적 구조가 유사하다는 것을 보여주었지만 DLS는 단백질간 상호 작용의 잠재력은 각 완충액에서 다르다는 것을 보여주었습니다. 이를 함께 해석하면 이 연구의 결과는 단백질간 상호 작용이 mAb-A의 응집 형성을 통제하는 데 중요한 역할을 한다는 점을 시사합니다. 저자는 또한 이 연구로 얻은 지식이 mAb-A 포뮬레이션 개발에 유용하지만 이를 근거로 다른 mAbs를 추정해선 안된다고 언급하고 있습니다.
정제 및 보관 중 바이오 약제의 단백질 가수 분해도 문제가 될 수 있습니다. 숙주 세포 프로테아제는 재조합형 단백질의 품질에 영향을 미쳐 중대한 제품 손실을 야기할 수 있습니다. 풀리거나 부분적으로 접힌 단백질은 접힌 단백질보다 단백질 가수 분해가 발생하기 더 쉬우며, 접힌 단백질은 오스몰라이트의 첨가로 단백질 가수 분해를 없애고 안정화를 높일 수 있습니다.
Mueller 등.[29]의 연구에서는 면역글로불린 M(IgM)의 단백질 가수 분해를 방지하는 메커니즘을 연구했습니다. IgM은 치료제 후보로 새롭게 등장했지만 본질적으로 불안정하다는 평판이 있습니다. 이 연구에서는 프로테아제 펩신, 파파인, α-키모트립시노겐을 정제된 IgM, mAb 85에 추가하여 부형제의 유무에 따른 분해 과정을 분석하였습니다. 부형제로 글리신과 소르비톨을 첨가한 결과, MicroCal VP-Capillary DSC로 분석했을 때 mAb 85 구조적 안정성이 증가하는 것으로 확인되었습니다. 2–3회의 열 전이에서 풀린 mAb 85는 완충액의 pH에 의해 결정되며 이러한 전이는 서로 다른 영역이나 구조 영역에 대응되었습니다. pH 5.5 및 pH 7.4에서 20%의 소르비톨 또는 1M 글리신, 또는 두 가지를 모두 첨가했을 때 TM가 크게 증가했습니다. 이는 소르비톨 및 글리신에 의한 보호가 어떻게 발생하는지에 대한 의문을 키웠습니다. 한 가지 가능성은 아마도 표준형이 압축된 형태로 바뀜에 따라 이러한 부형제에 의해 프로테아제가 억제되는 것입니다. 다른 가능성은 IgM의 압축으로 인해 단백질 분해 분할에 도달하기 어려워 진다는 것입니다.
메커니즘을 밝히기 위해 저분자량 기질의 단백질 분해 분할이 테스트되었습니다. 이 기질들은 선호 배제 메커니즘을 통한 형태 압축으로 안정화되지 않습니다. 파파인의 활동성은 약간 증가한 반면 키모트립시노겐의 활동성은 거의 변하지 않았습니다. 이는 부형제가 활동성 감소 없이 파파인을 안정화했음을 의미합니다. 이러한 결과는 mAb 85의 형태적 안정성 전반에서 부형제의 보호 효과가 단독으로 달성되며, 그 과정에서 압축이 증가하고 프로테아제의 분할 부위에 대한 접근성이 감소할 수 있다는 점을 시사합니다. 따라서 정제 및 포뮬레이션 중에 소르비톨 및 글리신과 같은 부형제를 추가하면 바이오 약제 포뮬레이션에서 프로테아제 억제제에 대한 요구 사항을 줄이거나 아예 없애는 데 도움이 될 수 있습니다.
DSC와 기타 생물물리학 방법을 특정 전달 시스템에 특정한 포뮬레이션 개발에 활용할 수 있는 방법의 예시는 Morar-Mitrica 등의 논문에 나와 있습니다 [30]. Otelixizumab은 인간 CD3를 타겟으로 하는 인체적합화 mAb(IgG1)입니다. 임상 투여량이 낮기 때문에(투여당 0.1mg ~ 0.5mg) 약품은 0.2mg/mL의 농도로 개발되었습니다. 투여에는 일반 식염수가 든 IV 백에 mAb를 희석하는 과정이 필요하며 이후 주입 펌프를 통해 전체 백의 내용물을 전달하게 됩니다. 이러한 과정은 IV 백의 단백질 농도를 0.002mg/mL까지 낮출 수 있습니다. 단백질 농도가 낮기 때문에 IV 백 및/또는 주입 펌프 시스템과의 상호 작용으로 인해 상당한 양의 단백질이 손실될 위험이 큽니다. 기존의 생물물리학적 포뮬레이션 개발과 사용 안정성 연구를 통해 흡착 손실을 줄이고 산화 분해를 줄이는 약품이 개발되었으며 액상 포뮬레이션은 냉장 조건에서 안정성을 보여주었습니다.
표준 포뮬레이션 선별을 위해 0.1% 폴리소르베이트 80(PS80) 유무에 따른 otelixizumab의 TM 값이 DSC 서모그램에서 측정되었습니다. PS80 유무에 따른 단백질의 서모그램은 일정한 풀림 프로필로 유사했으며, 이는 계면활성제 기능으로서 HOS의 변화가 없다는 점을 의미합니다. 2개 풀림 전이에 상응하는 최소 2개 종/영역이 DSC에 의해 명확하게 식별되었습니다. PS80의 유무에 따른 mAb의 DSC 결과는 TM1과 TM2에 큰 차이가 없음을 보여주었습니다. 또한 다른 관련 DSC 유도 열역학 매개 변수(T1/2 및 풀림의 총 엔탈피)의 비교에서 나타나듯 PS80은 mAb의 열적 안정성에 영향을 미치지 않습니다.
폴리소르베이트와 같은 원재료에는 바이오 약품에 잠재적인 산화 손상을 일으켜 결과적으로 효능을 저하시키고 원치 않는 면역원성 반응을 일으킬 수 있는 과산화물이 상당량 포함될 수 있습니다. 중대한 분해 경로로서 산화의 위험을 평가하기 위해 히스티딘만 들어 있는 완충액(PS80 미포함)에 든 Otelixizumab를 과산화수소로 처리하여 산화시킨 다음 산화로 유도된 구조적 변화를 DSC로 평가하고 비산화 대조군과 비교했습니다. TM 분석은 일반적으로 mAb의 CH2 영역에 가해지는 첫 번째 풀림 전이에서 산화로 유도된 불안정화가 나타난다는 것을 보여주었습니다. TM1(저온 전이)은 크게 감소하였고 부수적으로 피크가 넓어졌습니다. 두 번째 전이(TM2)는 산화의 영향을 받지 않았습니다. 질량분광법(MS) 분석은 CH2 영역에서 메티오닌 잔류물에 노출된 부위가 과산화수소에 의해 90% 가량 산화되었음을 확인해주었습니다. 이러한 결과는 주요 산화 부위가 CH2 영역의 메티오닌 잔류물이며 산화가 해당 영역의 열적 불안정화와 상관관계가 있음을 입증했습니다. 저자는 저농도 치료용 mAbs의 투여가 문제가 있으며 개발 초기에 포뮬레이션 개발과 사용 안정성 연구를 수행하는 것이 중요하다고 결론지었습니다.
본 백서에 제시된 결과는 프리포뮬레이션 및 포뮬레이션 개발 중에 생물물리학적 안정성 분석으로서 DSC를 함께 활용하는 것의 중요성과 효과성을 명확하게 입증하고 있습니다. 바이오 제약 회사는 DSC 결과를 다른 안정성 분석과 함께 사용하여 가장 안정적인 포뮬레이션에 대해 정보에 기초한 의사결정을 내릴 수 있으며, 이는 곧 최종 포뮬레이션에서, 그리고 약품으로서 단백질이 장기 안정성 문제와 응집 문제를 보일 가능성이 낮아진다는 것을 의미합니다. 달리 말하면 약물 생산의 경제성이 높아지고 최종 약물 포뮬레이션이 활성 상태로 안정적이고 안전하게, 정확히 접힌 형태로 유지될 가능성이 높아진다는 뜻입니다.
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Biophysics for Therapeutic Protein Development(치료용 단백질 개발을 위한 생물물리학), L.O. Nahri (ed.), Springer NewYork, USA (2013).
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State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization Volume 3. Defining the Next Generation of Analytical and Biophysical Techniques(치료용 단일클론 항체 특성 분석을 위한 첨단 및 신생 기술 3권, 차세대 분석 및 생물물리학 기법의 정의), J.E. Schiel, D.D. Davis, O.V. Borisov (eds.), ACS Symposium Series Vol 1202 (2015) DOI: 10.1021/bk-2015-1202.
