정적 광 산란은 분자에 의해 산란되는 빛의 세기와 해당 분자량 및 크기 사이의 관계를 사용하여 분자량을 측정하는 기법입니다. 이러한 관계는 Rayleigh 이론에 의해 설명되고, 이 이론에 따르면 분자의 분자량은 산란광의 Rayleigh 비율, 즉 입사광 강도 대비 산란광 강도의 비율에 비례합니다.
모든 정적 광 산란 장비는 시료에 의해 산란된 빛의 양을 검출하여 분자량을 측정하지만, 분자의 크기가 클수록 각의존성이라는 두 번째 인자가 중요한 의미를 갖게 됩니다. 각의존성은 산란광의 강도 및 계산된 분자량에 영향을 줍니다. 따라서 계산에서 각의존성을 고려해야 합니다.
| GPC | 겔 투과 크로마토그래피 |
| SEC | 크기 배제 크로마토그래피 |
| LALS | 저각 광 산란(Low angle light scattering) |
| RALS | 직각 광 산란(Right angle light scattering: 90° 광 산란) |
| MALS | 다각도 광 산란(Multi angle light scattering) |
| SLS | 정적 광 산란(Static light scattering) |
| DLS | 동적 광산란(Dynamic light scattering) |
| Rg | 회전 반지름(Radius of gyration) |
| RH | 유체역학적 반경(Hydrodynamic radius) |
| MW | 분자량(몰 질량) |
| Mn | 수평균 분자량(Number-average molecular weight) |
| Mw | 중량평균 분자량(Weight-average molecular weight) |
| Mz | Z평균 분자량(Z-average molecular weight) |
| A2 | 2차 비리얼 계수, B22 |
광 산란은 혼란스런 주제일 수 있습니다. 광 산란이라는 표제 밑에는 서로 다른 여러 가지 기법이 소개되기 마련이고 측정될 수 있는 파라미터 또한 다양합니다. 일부 시스템에서는 단일 장비에서 둘 이상의 기법을 사용하기 때문에 서로 다른 기법 간의 경계선이 모호해질 수 있고, 응용 분야에 적합한 광 산란 기술을 고려할 때 가장 중요한 인자를 간과하기 쉽습니다.
고전적 광 산란이라고도 하는 정적 광 산란은 분자량 및 분자의 회전 반경을 측정하는 데 사용되는 기법입니다. 정적 광 산란 범주에는 SLS, MALS, LALS 및 RALS 등의 약자로 표기되는 서로 다른 여러 가지 기술이 있습니다. 각 기법은 미묘하게 서로 다르며 장점과 단점을 갖고 있습니다.
이 백서에서는 정적 광 산란의 원리 및 이론을 자세히 설명합니다. 이론, 기법 및 여러 기술을 설명하고 비교하였습니다. 본 백서를 읽음으로써 독자는 이러한 측정에 대한 배경 지식을 이해할 수 있고, 이 정보를 바탕으로 응용 분야에 가장 적합한 솔루션이 무엇인지 선택할 수 있습니다.
각 섹션에서는 세부 내용을 풍부하게 제공하지만, 이에 앞서 섹션에 포함된 정보를 요약한 몇 가지 요점을 먼저 제시하여 해당 섹션의 자세한 내용을 읽을 필요가 있는지 독자가 결정할 수 있습니다.
분자량은 개별 분자의 질량을 기술하는 특성입니다. 과학적인 의미에서 분자량이란 시료 1 몰을 만드는 데 필요한 물질의 질량입니다. 예를 들어, 탄소의 분자량은 12g/mol입니다. 분자량의 단위로는 몰당 그램(g/mol)이 사용됩니다. 그러나 이 단위는 종종 돌턴(Da)이라고 불리며, 때로는 더 편리하게 킬로 돌턴(kDa)이라고 부릅니다.
순수 단백질 시료의 경우 고정된 분자량을 가지며, 시료 내의 모든 단백질 분자는 동일한 분자량을 갖습니다. 천연 또는 합성 고분자 시료의 경우에는 특정 시료 내에 있는 분자의 분자량 분포에서 다양한 형태가 나타날 수 있습니다. 분포의 전체 너비를 기술하는 용어로는 '다분산성'이 있습니다. 분자량 범위가 매우 좁은 시료에 대해서는 다분산성이 낮거나 단분산성이 매우 높다고 표현합니다. 분자량 범위가 상대적으로 넓은 시료에 대해서는 다분산성이 높다고 표현합니다.
특히 천연 및 합성 고분자를 비롯한 대다수의 시료는 다양한 분자량을 함유하고 있습니다. 이러한 분자량 분포는 여러 가지 방법으로 기술될 수 있고, 그중에 널리 수용되는 방법은 각각 수평균, 중량평균 및 z평균을 나타내는 Mn, Mw 및 Mz이라는 분자량 모멘트를 사용하는 것입니다. 이러한 모멘트는 아래에 표시된 방정식으로 정의됩니다. 여기서, ci 및 Mi는 각 데이터 슬라이스에서의 농도 및 분자량입니다.
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직관적으로 알 수 있듯이, 수평균 분자량은 물질의 총 질량을 분자의 총수로 나눈 수치 평균입니다. 이 분자량에서는 질량이 더 낮고 개수가 많은 분자에 가중치가 주어집니다. 증기 압력 내림, 응고점 강하 및 삼투압 등의 특성은 분자의 크기가 아니라 분자의 개수에 따라 달라집니다. 중량평균 분자량은 분자 질량에 곱하여 계산하기 때문에 분포에서 크기가 더 큰 분자에 가중치가 주어집니다. 확산, 침강, 광 산란 등의 특성은 분자의 크기와 질량에 따라 달라집니다. z평균 분자량은 분자의 분자량을 추가로 곱하여 계산됩니다. 따라서 z평균 분자량은 시료에서 가장 큰 분자에 매우 큰 가중치가 주어지고, 원심 분리 기법을 통해 바로 측정될 수 있습니다.
이러한 세 가지 값을 사용하면 전체 분자량 분포를 파악할 수 있습니다. 이러한 값이 서로 근접할수록 다분산성은 낮아지고 서로 멀어질수록 다분산성이 높아진다는 점은 명확합니다. 다분산성은 이 방정식에 따라 정의됩니다.
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Mw는 항상 Mn보다 크거나 같기 때문에 다분산성(PD)의 가능한 최소값은 1이지만, 이론적으로 상한은 없습니다. 천연 및 합성 고분자는 넓은 범위의 다분산성을 갖지만, 단백질의 경우에는 분자량이 고정되어 있기 때문에 정상적인 단백질에서는 다분산성이 1에 근접하여 매우 낮을 것으로 예상할 수 있습니다.
분자 크기란 분자의 물리적 크기입니다. 일반적으로 크기를 기술하기 위해 한 가지 값이 사용됩니다. 이 값은 측정 대상 분자와 동등한 크기를 갖는 구형의 반경입니다. 가장 널리 사용되는 두 가지 분자 크기 값은 RH(유체역학적 반경) 및 Rg(회전 반경)입니다. 유체역학적 반경은 연구 대상 분자와 동일한 속도로 확산되는 등가 구형의 반경입니다. 이 반경은 동적 광 산란 또는 고유 점도로부터 계산되기 때문에 여기서는 더 이상 다루어지지 않습니다. 유체역학적 반경에 대한 자세한 내용은 기술 노트, “동적 광 산란: 30분 소개” 및 “GPC/SEC를 사용한 단백질과 중합체 분자 크기”(참고 문헌 참조)를 참조하십시오.
회전 반경은 분자 내에서 질량 중심부터 질량 코어까지의 반지름의 제곱 평균 제곱근입니다. 이 반경은 Rrms(제곱 평균)라고도 합니다. 분자 크기의 단위는 나노미터(nm)입니다. Rg는 정적 광 산란을 사용하여 계산되기 때문에 본 문서의 뒷부분에서 보다 자세히 다루어집니다.
광자가 분자와 충돌하면 광자 에너지의 일부는 분자 내에서 진동 쌍극자를 개시하는 데 사용됩니다. 이후에 이 에너지는 분자에 의해 모든 방향에서 빛으로 재방출됩니다. 이 현상은 흰 구름과 일몰에서 또는 태양 광선이나 프로젝터의 광선을 통과하는 먼지 등에서 매일 관측되고 있습니다. 광 산란의 원리는 분자와 관련된 다수의 특성을 측정하는 데 사용될 수 있습니다.
분자 및 입자에 의해 산란되는 빛의 특성은 Rayleigh 방정식에 정의된 대로 빛을 산란시키는 물체에 따라 달라집니다.
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간단히 설명하면 Rayleigh 방정식을 통해 알 수 있는 것은 주어진 각도에서의 산란광의 강도는 연구 대상 시료의 분자량 및 분자 크기 등의 여러 인자에 따라 달라진다는 점입니다. Rayleigh 방정식에서 알 수 있듯이 분자량이 높고 크기가 큰 분자가 더 많은 빛을 산란시킵니다. 산란광의 강도 증가는 분자량에 대해 선형적이지만, 크기에 대해서는 선형적이지 않습니다.
따라서 Rayleigh 방정식의 다른 인자를 모두 알고 있다면 산란광의 강도(Rθ와 관련됨)를 측정하고 시료의 분자량을 계산할 수 있습니다.
정적 광 산란(SLS)에서는 검출된 신호가 ‘정적’이거나 안정적인 광학기기 배치를 사용합니다. 다른 상수가 알려진 상태에서 시료에 의해 산란되는 빛의 강도를 측정함으로써 시료의 분자량을 계산할 수 있습니다.
정적 광 산란이라는 용어는 관련성이 없는 것은 아니지만 입자 크기 측정을 위한 별개의 기법인 동적 광 산란과 구별하기 위해 사용됩니다. 동적 광 산란에 대한 자세한 내용은 Malvern 웹사이트에 있는 Malvern 기술 노트 “동적 광 산란: 30분 소개” 또는 ‘정보제공’ 백서 “입자 특성 분석에 대한 기본 안내서”를 참조하십시오.
정적 광 산란 측정은 큐벳에서 수행되거나 겔 투과 크로마토그래피(GPC)/크기 배제 크로마토그래피(SEC) 시스템에서 수행될 수 있습니다. 크로마토그래피 시스템을 사용하면 시료 준비 및 정화와 관련된 여러 가지 문제가 제거되기 때문에 SLS 기법으로 가장 널리 사용됩니다. 또한 GPC/SEC를 채택하면 광 산란 데이터를 농도 검출기의 데이터와 손쉽게 결합하여 시료의 농도를 동시에 함께 측정하고 두 가지 정보를 계산에서 활용할 수 있습니다. 가장 일반적인 농도 검출기는 굴절률(RI) 검출기이지만, 자외선(UV) 흡수 검출기도 사용할 수 있습니다.
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앞에서 보여 준 Rayleigh 방정식에는 1/Pθ라는 항이 있고, 지금까지는 이 항의 값을 알고 있는 것으로 가정했습니다. 그러나 실제로는 그렇지 않으며, 여러 광 산란 장비 간의 모든 차이점은 바로 여기에서 비롯됩니다.
Pθ 또는 형태 인자는 분자 크기 및 산란이 측정되는 각도와 관련 있습니다. 이 항은 다음과 같이 정의됩니다.
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이 방정식을 통해 1/Pθ은 시료 및 측정과 관련 있는 여러 인자에 따라 달라진다는 것을 알 수 있습니다. 이러한 인자에는 용매 굴절률(n0), 진공에서의 레이저 파장(λo), 측정 각도(θ) 및 측정 대상 분자의 크기(Rg)가 포함됩니다.
따라서 큰 분자의 경우 산란광의 양이 측정 각도에 따라 달라지게 됩니다. 이 현상을 ‘각의존성’이라고 하며, 분자 크기가 증가할수록 산란된 광자가 더 이상 독립적으로 산란되지 않고 그림 2와 같이 상호 간에 건설적 및 상쇄적으로 간섭하기 때문에 이 현상이 나타납니다.
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분자가 레이저에 비해 작으면 그림 2A에서처럼 점 산란체로 작용합니다. 이 경우 빛은 모든 방향에서 고른 강도로 분자에 의해 산란됩니다. 이 분자는 '등방성 산란' 이라고 합니다.
그러나 분자가 레이저에 비해 클수록 분자의 크기 및 구조가 중요해집니다. 레이저의 개별 광자가 분자 내의 여러 점에 의해 산란되는 것입니다. 이는 Rg에 따라 달라집니다. 이러한 산란된 광자는 위상이 서로 다르기 때문에 서로 간섭하게 되고, 이로 인해 측정된 강도는 관측 위치에 따라 달라집니다. 이 분자는 '이방성 산란' 이라고 합니다. 우리가 관심을 갖는 크기에서는 모든 간섭이 상쇄적이기 때문에 등방성 산란체를 가정한 경우에 비해 강도가 항상 낮게 나타납니다. 따라서 Rayleigh 방정식으로 분자량을 계산하는 데 이 강도를 사용하면 분자량이 너무 적게 산출됩니다.
이 효과를 제거하기 위하여 Reyleigh 방정식처럼 0°에서 산란광을측정하는게 가능하다면 Sin2(θ/2)는 0이 되므로 1/Pθ은 1이 됩니다. 따라서 0°에서 산란광의 강도는 간섭의 영향을 받지 않고, 90° 각도에서 작은 분자를 측정할 때와 동일하게 강도와 분자량을 관련시킬 수 있습니다. 아쉽지만, 0°에서는 조사되는 레이저의 강도가 산란광의 강도보다 훨씬 높기 때문에 순수하게 산란된 빛만 분리할 수 없습니다. 0°에서 바로 측정할 수 없기 때문에 다른 기법을 찾아야 합니다.
각의존성이 어디서부터 시작하는지 결정할 때는 레이저 파장의 1/20보다 작은 직경에서는 분자가 등방성으로 산란되고 이 레벨보다 높으면 비등방성으로 산란된다는 경험 법칙을 따르는 것이 좋습니다. 대부분의 장비에서 레이저 파장은 633nm와 670nm(적색) 사이이기 때문에 등방성 산란의 한계는 반경 15.8nm와 16.8nm 사이입니다. 레이저 파장에 대한 의존성 때문에 파장이 532nm(녹색)인 레이저에 대해 동일한 계산을 적용하면 13nm라는 값이 나옵니다.
15nm 정도의 값이 각에 대한 의존성 없이 측정할 수 있는 상한임과 동시에 신뢰성 있게 측정 가능한 Rg값의 하한이기도 합니다. “데이터로부터 분자 크기, Rg를 얻는 방법”을 참조하십시오.
각의존성 문제를 서로 다른 방식으로 극복하기 위해 여러 유형의 광 산란 장비가 설계되었고, 이러한 장비는 다음 섹션에 설명되어 있습니다.
각의존성을 극복하려면 다른 각도에서의 데이터를 기반으로 0°에서 산란광의 강도가 얼마인지 결정해야 합니다. 각의존성을 계산하고 표현하기 위한 가장 좋은 방법은 Zimm 플롯을 단순화하여 2차 비리얼 계수가 필요 없는 ‘Guinier 플롯’을 사용하는 것입니다.
Guinnier 플롯은 각도(sin2(θ/2))의 함수로서 KC/Rθ의 플롯입니다. 다른 플롯 및 모델을 사용할 수 있지만 이 플롯이 가장 널리 사용됩니다. 그림 3에 이 플롯의 예가 나와 있습니다.
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광 산란 강도는 원하는 각도에서 측정됩니다. 시료의 농도 및 기타 요인에 대한 지식과 함께
KC/Rθ 을 산출할 수 있고 sin2 (θ/2) 함수 그래프로 플롯 y 절편(각도 0°와 같음)은 1/Mw이고, 이 값으로부터 분자량을 쉽게 계산할 수 있습니다.
선의 초기 기울기는 다음과 같습니다.
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그런 다음, 이 방정식으로부터 Rg가 비교적 쉽게 계산될 수 있습니다. 그러나 작은 분자 크기에서는 이 기울기가 매우 작고 데이터에서 잡음에 가려질 수 있습니다. 분자가 레이저 광의 파장에 비해 상당한 크기로 커질 때에만 신뢰 가능한 Rg 값을 얻을 수 있을 만큼 기울기가 커집니다. 위에 설명한 대로 633nm 레이저에서 Rg의 임계값은 ≈15nm입니다. 그러나 시료, 용매 및 측정 조건에 따라서 Rg측정의 절대 한도가 15nm보다 낮거나 높을 수 있습니다. 다수의 MALS 장비 제조업체에서는 장비 사양에 10nm 또는 이보다 훨씬 낮은 한도를 적용하고 있습니다. 이 한도는 주로 dn/dc 값이 높은 표준 중합체에 대해 이상적인 조건하의 고농도에서 적용됩니다. 실제로는 모든 시료에서 이 한도에 도달할 수 없습니다. 이와 정반대로 비이상적인 조건하에서 dn/dc 값이 낮은 시료의 경우에는 측정 가능한 가장 작은 Rg가 공칭값 15nm보다 훨씬 더 클 수 있습니다.
서로 다른 4가지 유형의 SLS 장비를 사용할 수 있습니다. RALS, LALS, 하이브리드 RALS/LALS 및 MALS.
RALS 장치는 사용 가능한 광 산란 장비 중에서 가장 간단합니다. 이 장비는 그림 4A에서처럼 입사 광선에 대해 90°인 각도에서 산란되는 빛의 강도를 측정합니다. 시료의 분자량은 측정된 강도 및 시료 농도로부터 바로 계산됩니다. 그림 4B의 Zimm 플롯에서 산란광의 강도는 y 축으로부터 멀리 떨어진 곳에서 측정되고, 산란시키는 시료는 등방성(즉, 모든 각도에서 균일)인 것으로 가정합니다.
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RALS 시스템에는 여러 가지 장점이 있습니다.
그러나 RALS 검출기에는 몇 가지 제한이 있습니다.
단백질은 거의 항상 반경이 15nm 미만이고 빛을 약하게만 산란시키므로 단백질에 대해서는 민감한 검출기가 필요합니다. 이러한 이유로 RALS 검출기는 단백질 분자량 측정에서 탁월한 성능을 보여 줍니다.
LALS 검출기는 그림 5A와 같이 가능한 한 0°에 근접한 각도에서 산란되는 빛의 강도를 측정합니다. 이 검출기에는 강도가 0°에서의 강도와 매우 근접하고 이에 따라 계산한 분자량이 분자의 실제 분자량과 매우 가깝다는 장점이 있습니다. LALS 검출기로 간주되려면 각도가 10° 미만이어야 하고, 가장 일반적인 LALS 검출기의 측정 각도는 7°입니다. 그러나 측정 각도가 0°에 가까울수록 측정의 정확도가 높아집니다. 이는 측정 대상 분자의 크기와 상관없습니다. Zimm 플롯(그림 5B)을 살펴보면 LALS 측정이 축에 매우 근접해 있고 y 절편과 매우 가까운 것을 알 수 있습니다. 이는 7°에서의 측정에 의한 오차가 매우 적다는 것을 의미합니다. 7°에서 LALS 측정을 수행할 경우 sin2(θ/2)는 0.0037에 불과하여 가장 큰 분자에 대해서도 MW의 오차가 1% 미만에 지나지 않습니다.
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LALS 시스템에는 여러 가지 장점이 있습니다.
LALS 검출기에도 여러 가지 제한이 있습니다.
전반적으로 LALS 측정은 정적 광 산란을 이용하여 분자량을 정확히 측정할 수 있게 해 줍니다. LALS는 합성 및 천연 중합체 같은 큰 비등방성 산란체의 분자량을 측정하는 경우에 특히 유용합니다.
위에서 살펴본 내용에 따르면 RALS 검출기와 LALS 검출기가 상호 보완적이라는 점이 명확합니다. RALS 검출기에는 작은 등방성 산란체를 측정할 수 있는 감도가 있고, LALS 검출기는 최고의 정확도로 큰 분자의 분자량을 측정할 수 있습니다. RALS/LALS 하이브리드는 그림 6A에서처럼 두 가지 측정을 단일 셀에 결합한 것입니다. Zimm 플롯에서 RALS 검출기는 크기가 등방성 산란의 임계값인 ≈15nm 미만의 분자를 측정하는 데 사용됩니다. LALS 검출기는 크기가 등방성 산란의 임계값인 ≈15nm를 초과하는 분자를 정확히 측정하는 데 사용됩니다. 소프트웨어는 검출기 신호에 따라 자동으로 LALS에서 RALS로 전환합니다. 비등방성으로 산란시키는 시료의 경우, 계산한 두 가지 분자량의 비율이 Pθ를 추정하는 데 사용될 수 있습니다. 그런 다음, 이 값이 불규칙 코일 또는 강체 구형 등의 구조 모델을 가정하여 Rg 값을 추정하는 데 사용될 수 있습니다.
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RALS/LALS 조합에는 두 가지 장점이 있습니다.
RALS/LALS 하이브리드의 한계는 다음과 같습니다.
전반적으로, RALS/LALS 하이브리드는 RALS 및 LALS의 장점을 제공하고 어느 쪽의 결점도 포함하지 않습니다. 따라서 RALS/LALS 시스템은 모든 시료의 분자량을 측정하는 데 탁월한 성능을 보여 줍니다.
이름에서 알 수 있듯이, MALS 검출기는 그림 7A와 같이 여러 각도에서 산란광의 강도를 측정합니다. Zimm 플롯(그림 7B)을 이용하면 외삽을 통해 0°의 값을 얻어 분자량을 계산할 수 있습니다. 이 외삽 플롯의 기울기로 분자 크기, Rg를 정확히 계산할 수 있습니다.
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MALS 검출기에는 여러 가지 고유한 장점이 있습니다.
그러나 MALS 시스템에도 몇 가지 제한이 있습니다.
MALS를 사용하여 측정할 때 고려해야 할 가장 중요한 요인은 외삽의 형태가 알려져 있지 않고 정확한 피팅은 특히 낮은 각도의 개수 및 점의 정확도에 따라 달라진다는 것입니다. 따라서 가장 정확하게 0°에 외삽되도록 가능한 한 많은 개수의 낮은 각도를 MALS 장비에서 제공하는 것이 중요합니다. 일반적으로 외삽의 정확도를 최대화하려면 많은 각도를 갖는 것이 도움이 됩니다.
요약하면, MALS는 모든 유형의 시료에 대해 분자량 및 Rg를 측정할 수 있는 범용 솔루션을 제공하지만, 설계의 특성상 측정에서 일부 한계점을 드러냅니다.
광 산란 기법을 종종 ‘완전하다’고 하지만 그 의미가 자주 오해되고 있습니다.
컬럼에 대해서는 보정이 필요하지 않지만, 모든 광 산란 장치에는 특정 형태의 보정이 필요합니다. 유일한 문제는 장치를 어떻게 보정해야 하는 것인가 이며, 보정은 여러 가지 방법으로 할 수 있습니다.
다른 모든 보정에서와 마찬가지로 광 산란 보정의 원리는 측정 대상 매개 변수에 대한 응답 신호의 크기를 참조하는 것입니다. 정적 광 산란에서는 광검출기로부터 얻은 신호의 크기를 산란광의 강도와 관련시킨 후 시료의 분자량과 관련시킵니다. Rayleigh 방정식에서 설명된 시료에 영향을 받는 모든 인자뿐 아니라, 산란광의 측정 강도 또한 장비에 영향을 받는 다음과 같은 여러 변수에 따라 달라집니다.
시스템의 모든 구성 요소를 측정에 필요한 수준의 정확도로 특성화할 수 없기 때문에 구성 요소는 모두 보정 단계에서 고려됩니다.
시스템은 두 가지 방법으로 보정될 수 있으며, 두 방법은 기능적인 면에서 동일합니다.
분자량 표준 기반 보정의 원리는 SLS 검출기가 GPC/SEC 시스템에 연결된 상태에서 SLS 검출기를 통해 분자량이 알려진 시료를 작동시키는 것입니다. 광 산란 검출기의 응답 크기, 알려진 시료 농도, 분자량 및 dn/dc은 장비 응답 계수 또는 광 산란 검출기에 대한 보정 상수를 계산하는 데 사용됩니다. 용매 굴절률 및 레이저 파장 등의 다른 값을 무시하면 광 산란 검출기 보정 상수가 다음과 같이 정의됩니다.
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표준시료를 사용할 경우, 농도 및 주입 용량(및 질량)은 표준시료의 분자량 및 dn/dc으로 알 수 있습니다.
이를 통해 보정 상수가 계산되어지며, 광 산란 검출기에서 모든 각도에 걸쳐 동시에 보정이 수행될 수 있습니다.
보정 상수가 결정되면 모든 시료의 분자량을 측정할 수 있습니다.
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Mw는 시료의 분자량이고,
δLS는 시료에 의해 산란되는 빛의 측정된 강도이고,
dn/dc은 표준시료의 농도에 따른 굴절률의 변화량이며,
mass는 시료의 주입된 질량이고,
kls는 광 산란 보정 상수입니다.
여러 검출기를 포함하는 GPC/SEC 시스템에서는 특성화 및 추적 가능성이 우수한 표준 시료를 사용하여 모든 검출기가 동시에 보정될 수 있습니다. 이 방식으로 검출기를 보정하면 여러 검출기 유동 셀 사이의 검출기 간 체적 및 시료가 검출기 사이를 이동함에 따라 발생하는 밴드 확산과 테일링이 동일한 단계에서 모두 고려될 수 있다는 이점도 있습니다.
마지막으로, 이 방법에는 언제든지 사용자가 시스템 보정을 점검하고 재보정할 수 있다는 이점이 있습니다. 이 이점은 광원의 약화, 유동 셀의 청결도, 검출기 라인 교체 등의 여러 가지 요인으로 인해 장비 상수가 시간의 흐름에 따라 변하기 때문에 특히 유용합니다.
분자량 표준 기반 보정에서는 검출기 간 체적 및 피크 확장 매개 변수가 모두 계산되기 때문에 모든 장비 응답 계수/보정 상수가 동시에 도출될 수 있습니다. 이 보정은 시스템 보정을 위한 가장 효과적인 방법을 제공할 뿐 아니라, 설계 특성상 표준의 응답을 보정 시점의 응답과 비교하여 시스템의 보정을 점검할 수 있는 명료한 방법을 제공합니다.
산란 표준 기반 보정의 원리는 광 산란 유동 셀을 산란이 알려진 톨루엔 등의 용매로 채우는 것입니다. 톨루엔은 잘 특성화된 Rayleigh 비율(입사광 강도 대비 산란광 강도의 비율)을 갖기 때문에 톨루엔으로부터 관측된 산란 신호를 측정하면 시료에서 발생하는 산란 신호를 계산할 수 있습니다. 시료에 대한 Rθ는 방정식에 따라 계산됩니다.
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시료 분자량은 이 Rθ 값을 Rayleigh 방정식에 입력하여 계산됩니다. 따라서 이 경우에는 보정 상수가 필수적입니다.
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검출기를 보정하기 위해 분자량 값이 필요한 것은 아니지만, 표준을 사용하여 알려진 시료에 대한 광 산란 검출기의 응답을 측정한다는 점에서 산란 표준을 적용한 보정의 원리는 동일합니다.
이 방법에는 중대한 몇 가지 다른 결점이 있습니다.
전반적으로 산란 표준 기반 보정은 더 많은 작업을 필요로 하고 보정을 향상시키지 않으며, 시스템의 정확한 보정을 더 어렵게만 합니다.
