GPCR의 결합 동역학

서론

G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 분자 및 세포 반응을 유도하기 위해 혈장막 전체에 세포외 자극을 전달하는데 중요한 역할을 하는 다수의 내재성 막 단백질로 구성됩니다. 이들은 진핵생물에서 다양한 생리학적 과정을 조절하며 사용 가능한 의약품의 30% 이상이 GPCR을 표적으로 할 만큼 최대의 치료 표적 그룹입니다.

세포막 단백질은 막 모방 환경의 요건과 세포막에서 추출한 후 불안정성으로 인해 연구하기가 어렵기로 악명이 높습니다. 여기서는 펩타이드 리간드 작용제(NTA11)와 뉴로텐신 수용체 1(NTSR1)¹의 열 안정화 변종 간의 상호작용을 최고의 분해능으로 측정하는 Creoptix WAVE의 기능을 보여줍니다. 이 GPCR은 저혈압, 고혈당증, 저체온증, 항통각수용성, 장 운동 및 분비 조절 등 뉴로텐신의 여러 기능을 매개합니다².

실험방법

수용체를 avi 표지를 통해 체내에서 비오티닐화 상태로 스트렙타비딘 사전 코팅 센서(WAVEchip DXH-STA)에서 포획했습니다. 측정된 펩타이드 작용제의 경우, Y11A 치환을 갖는 잔기 8-13으로 구성된 돌연변이 및 절단된 형태의 뉴로텐신(MW 725 Da)을 사용했습니다. 3배 희석 시리즈의 7가지 분석물 농도(최고 농도 300nM)에 대해 선량 반응 곡선을 기록했습니다. 유량을 30μL/min으로 설정했습니다. 실행 완충액은 50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl 및 세제 라우릴 말토스-네오펜틸 글리콜(L-MNG)의 0.1%(w/v)였습니다³. 모든 측정은 25 °C에서 실시했습니다.

결과

정제된 비오티닐화 뉴로텐신 수용체가 1,350pg/mm²의 밀도로 스트렙타비딘 사전 코팅 센서(WAVEchip DXH-STA)에서 포획되었습니다. 펩타이드 작용제의 결합에 대한 선량 반응 곡선이 기록되었으며(그림 1), 이를 통해 질량 이송(MTL)에 대한 항이 포함된 1:1 상호작용 모델에 잘 피팅될 수 있는 결합 데이터를 도출했습니다. 획득한 동역학 속도 및 평형 상수는 표 1에 요약되어 있습니다.

그림 1: 분석물로서 변형된 뉴로텐신 펩타이드(MW 725 Da)와 리간드로서 열 안정화 뉴로텐신 수용체(NTSR1, 70kDa 단백질/세제 복합체) 간의 상호 작용에 대한 센서그램. 이 데이터는 WAVEcontrol 소프트웨어를 사용하는 질량 이송 제한(MTL)에 대한 항이 포함된 1:1 상호작용 모델로 피팅되었습니다

표 1: 대량 수송 제한(MTL)에 대한 항을 포함하여 1:1 상호작용 모델에서 얻은 NTA11 작용제의 동역학 속도 및 해리 상수

참고 문헌

1. Egloff, P., Hillenbrand, M., Klenk, C., Batyuk, A., Heine, P., Balada, S., Schlinkmann, K. M., Scott, D. J., Schütz, M., and Plückthun, A. (2014) Structure of signaling-competent neurotensin receptor 1 obtained by directed evolution in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, E655–62.
2. Krumm, B. E., and Grisshammer, R. (2015) Peptide ligand recognition by G protein-coupled receptors. Front. Pharmacol. 
3. Chae, P. S., Rasmussen, S. G. F., Rana, R. R., Gotfryd, K., Chandra, R., Goren, M. a, Kruse, A. C., Nurva, S., Loland, C. J., Pierre, Y., Drew, D., Popot, J., Picot, D., Fox, B. G., Guan, L., Gether, U., Byrne, B., Kobilka, B., and Gellman, S. H. (2010) Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization,  stabilization and crystallization of membrane proteins. Nat. Methods 7, 1003–1008.