Malvern Panalytical Panalytical의 NanoSight 나노 입자 추적 분석(NTA) 기법의 표준 측정 모드는 샘플 정적(static) 상태에서 수행됩니다. 이 경우 분석에서 유일한 운동은 입자의 브라운 운동입니다. NTA는 단일 입자 기법이므로 더 많은 입자가 측정에 포함되면서 분석의 통계적 대표성이 증가합니다. 샘플에 느린 흐름이 적용되면 농도 측정의 정밀도와 반복성이 크게 향상되어 더 많은 수의 새로운 입자가 측정 구역을 통과하여 실험 중에 분석됩니다.
Malvern PanalyticalPanalytical NanoSight NTA 장비는 서브마이크론 입자 크기(10nm~1µm)와 농도(입자/mL) 측정을 모두 제공합니다. NTA는 세포외 소포(엑소좀 포함), 바이러스, 단백질 응집체, 약물 전달 입자(리포솜과 고분자 입자 포함), 환경 및 나노독성학 샘플과 같은 다양한 유형의 샘플을 측정하는 데 사용됩니다. 더 나은 통계 데이터를 통해 각 샘플 유형이 이점을 얻을 수 있는 정도는 샘플의 특성(다분산성), 입자 농도, 획득한 반복 측정 횟수(즉, 캡처된 비디오 수)에 따라 달라집니다.
실린지 펌프를 사용하여 비디오 캡처 중에 샘플이 주입되는 중에 사용자는 다음을 수행할 수 있습니다.
반복성에 영향을 미치는 요인과 그 요인들의 조합은 다양합니다. 예를 들어 샘플의 다분산 수준이 높을수록 샘플이 완전히 대표성을 확보할 수 있도록 각 측정(비디오)이 길어져야 합니다. 현재 모범 사례 권장 사항은 사용자가 각 샘플에 대해 5 x 60s 비디오를 캡처하는 것입니다.1 각 샘플에 대해 여러 비디오를 캡처하면 추가 통계 분석(t-테스트 등)을 위해 데이터의 표준 오차를 생성할 수 있습니다.
또한 비디오 캡처 중에 샘플의 일정하고 매끄러운 흐름을 적용하면, 흐름이 측정 과정 내내 새로운 입자를 가시 영역으로 가져올 수 있으므로 실험당 더 나은 샘플링을 얻을 수 있습니다. 이 기술 노트에서는 100nm PLS 표준 비드를 사용하여 다양한 실린지 펌프 속도로 NanoSight NTA 크기 및 농도 측정의 정확도와 반복성을 입증합니다. 분석 조건의 견고성을 확인하기 위해 사용자의 실제 샘플로 유사한 실험을 수행해야 합니다.
NTA 크기 및 농도 측정은 mL당 1.7x108(+/-10%) 입자를 얻기 위해 MilliQ 물에 100,000X 희석한 100nm 폴리스타일렌 라텍스(PSL) 표준(102nm +/- 3nm, ThermoScientific)에 대해 수행되었습니다. 488nm 레이저 광원의 NTA 장비와 1mL Terumo 실린지가 포함된 NanoSight 실린지 펌프를 사용하여 샘플을 TEST 실행했습니다(5x60s 비디오). 데이타는 NTA 3.1 Build 48 소프트웨어를 사용하여 분석했습니다. 샘플은 NTA 소프트웨어에서 0~100AU(임의 단위) 범위의 유량으로 실행되었습니다.
크기와 농도의 반복성을 자세히 살펴보기 위해 실린지 펌프를 사용하거나(흐름) 사용하지 않은(정적) 10개의 다른 부분 샘플을 실행한 사용자에게 계산된 농도의 100nm PSL 표준 샘플을 제공했습니다(그림 1). 실린지 펌프를 사용하면 농도 측정의 정밀도가 향상되었습니다. 반복성은 실린지 펌프를 사용하지 않을 경우 15% CV에서 실린지 펌프를 사용할 경우 3% CV로 개선됩니다. 한편, 크기 정밀도, 정확도 및 반복성은 2% CV에서 실린지 펌프 사용 여부에 관계없이 영향을 받지 않습니다.
그림 1. 표준 정적 샘플 로딩을 사용하고 일정한 실린지 펌프 흐름을 유지할 때 동일한 샘플에 대한 10회 연속 실험을 통해 확보한 농도 데이터. 실행(Run)은 14 x 60s 비디오를 나타냅니다.
이러한 개선 사항은 용액에서 안정된 단분산 라텍스를 위한 것입니다. 일반적인 다분산 샘플의 경우, 처음에 잠재적 가변성이 상당히 클 수 있으며, 흐름 모드의 잠재적 이점도 그에 상응하여 클 수 있습니다. 최적의 유량은 다음 일련의 실험에 의해 결정되었으며, 사용자는 다른 물질에 적용할 방법을 설계할 때 이러한 실험을 재현해야 합니다.
Malvern Panalytical은 희석액의 추가 운동 측정이 아닌 입자의 고유 브라운 운동이 측정되도록 샘플의 입자가 관찰 영역(FOV)을 통과하는 데 약 10초가 걸리도록 실린지 펌프 유량을 설정할 것을 권장합니다. 예를 들어 입자가 5초 미만 안에 FOV를 통과하는 경우 희석액의 속도는 우세 운동으로 측정됩니다. 소프트웨어에서 이것은 입자가 고유의 브라운 운동보다 빠르게 움직이는 것으로 해석됩니다. 이는 샘플의 입자가 크기가 작다는 것을 의미합니다. 이 점을 증명하기 위해 100nm PLS 비드를 다양한 유량에서 테스트하여 샘플 속도가 증가함에 따라 크기에 미치는 영향을 관찰했습니다.
NanoSight 실린지 펌프 속도가 0(정적)에서 50AU인 경우, 측정된 입자 크기는 인증서에 명시된 범위(102nm +/- 3nm) 내에 있으며 통계적으로 동일합니다(그림 2). 속도가 50AU 이상에 도달하면(즉, 입자가 이상적인 약 10초 이내에 FOV를 통과함) 측정된 크기가 인증된 범위 아래로 떨어집니다.
그림 2. 100nm PSL 표준(102nm +/-3nm 인증)의 크기(nm) 대 유량(AU). 각 포인트는 5 x 60s 비디오로 구성됩니다.
이 실험은 각 상단 플레이트 유형에 대한 최대 권장 유량을 어떻게 얻었는지 보여줍니다. 다음 펌프 속도는 NanoSight 모델의 다양한 샘플 체임버 설정에 대한 권장 유량 설정 일반 가이드입니다.
측정할 샘플 유형 및 크기 범위에 따라 펌프 속도 설정에 약간의 차이가 있을 가능성이 높습니다. 항상 그렇듯이 각 사용자는 최적의 반복성을 위해 특정 기기 구성 및 샘플 유형으로 적절한 실린지 펌프 설정을 테스트하고 확인해야 합니다. 또한 유사한 샘플에서 결과의 우수한 재현성을 확보하기 위해 사용자는 샘플의 데이터 수집에 사용된 실린지 펌프 속도와 실린지 유형을 문헌에서 보고하는 것이 좋습니다.
100nm PSL 표준에서 제공되는 NTA 농도(농도 측정 업그레이드2 포함)는 0~60AU의 유량에서 우수한 정밀도와 정확도를 보여줍니다(그림 3). 60AU 이상에서는 샘플이 너무 빨리 움직여서 소프트웨어가 필요한 수의 비디오 프레임에 대한 일부 입자를 추적할 수 없어 농도가 떨어지므로 정확도가 떨어집니다.
그림 3. 특허받은 농도 업그레이드를 통해 알려진 농도(1.7x108 입자/mL +/-10%)의 100nm PSL 비드에 대한 NTA 농도 데이터.
실린지 펌프는 모든 NanoSight 시스템에 쉽게 설치할 수 있으며 NTA 소프트웨어로 제어할 수 있습니다. 유량의 단위는 임의 단위(AU)이며 사용되는 실린지 유형, 레이저 모듈 유형(LM12 또는 LM14) 및 상단 플레이트 유형(즉, 흐름 채널, 저용량 흐름 채널 및 O 링)에 따라 달라집니다. 전반적으로 NTA 소프트웨어를 사용하는 실린지 펌프의 작업 유량은 약 4µL/min이며, 이는 비디오 간에 수동으로 샘플을 전진시키는 것에 비해 실험 중에 사용되는 샘플이 적다는 것을 의미합니다('정적' 캡처).
샘플이 흐르는 방향은 사용되는 레이저 모듈의 유형에 따라 달라집니다(그림 4). NTA 소프트웨어에서 x 및 y 방향의 드리프트 보정(nm/s)이 분석할 입자의 브라운 운동은 남기면서 일정한 방향 흐름을 보정하므로 두 설정 모두 작동합니다. 따라서 입자(및 입자 크기)의 운동은 샘플의 유량이 아니라 샘플 입자의 브라운 운동에 의한 것입니다.
그림 4. a) 실린지 펌프를 LM12 모듈과 함께 사용할 때 수직 방향의 샘플 흐름. b) LM14 모듈을 사용할 때 수평 방향의 샘플 흐름.
NanoSight 실린지 펌프를 다양한 속도로 설정하여 데이터를 캡처하면서 알려진 농도의 100nm PSL 표준으로 NTA 크기 및 농도 측정을 조사했습니다. 실린지 펌프를 사용하면 농도 업그레이드 여부에 관계없이 농도 측정의 정밀도와 반복성이 향상됩니다. 흐름 채널 상단 플레이트의 권장 실린지 펌프 속도(NS500 흐름 채널 상단 플레이트의 경우 20~50AU 및/또는 입자가 FOV를 통과하는 경우 약 10초) 이내로 30~60s의 여러 비디오를 수집하고 농도 업그레이드를 실행함으로써 크기와 농도 모두에서 정밀도, 정확도 및 반복성을 확보할 수 있습니다.
