단백질 기반 치료법의 개발은 제약 산업에서 빠르게 성장하고 있는 분야입니다. 바이오약제는 인간과 동물에게 발생하는 많은 질병을 치료, 예방할 뿐만 아니라 체내에서 생산할 수 없는 중요 단백질을 대체하기 위해 점차 많이 사용되고 있습니다. 그러나 이러한 치료 효과를 내기 위한 제제에서 치료 단백질의 응집은 효과를 떨어뜨리고 잠재적으로는 약의 안전성과 효능을 손상할 수 있는 면역원성 효과를 유도하기도 합니다. 그러므로 치료 단백질과 기타 바이오약제를 개발, 제조, 저장할 때에는 응집을 모니터링하는 것이 필수적입니다.
지금까지 가장 널리 인정된 모니터링 방법에는 수동 현미경 검사, 광산란 검출, 차광, 크로마토그래피, 자동 이미징 기술이 결합된 미세유체공학이 있습니다. 이 방법들은 많은 응집 연구에 적합하지만 투명도와 모양이 광범위하거나 고농도로 존재하는 단백질 응집체에서는 어려움이 있을 수 있습니다. 또한 현미경 수준, 심지어 1마이크론 미만 수준의 입자에 대하여 R&D 및 품질 관리에 대한 관심이 증가하고 있지만 제한된 분해능 때문에 광학적 방법으로는 접근하기 힘든 경우가 많습니다. 마지막으로, 단백질 제제는 실리콘 오일처럼 제품 제조, 취급, 저장 중에 유입된 입자성 이물질이 존재하여 분석이 복잡해지는 경우가 많습니다. 이상적인 바이오약제 분석 방법은 응집체와 오염물을 명확히 구분하여 응집체만을 분석하는 방법일 것입니다.
Archimedes는 제제 내의 개별 단백질 응집체와 기타 입자를 검출, 집계하고 공명 질량 측정에 의해 질량과 크기를 측정하는 혁신적인 새로운 벤치톱 기기입니다. 새로운 방식은 수 마이크론부터 약 50nm까지 정확하고 재현성 있는 입자의 질량, 농도, 크기를 측정 할 수 있습니다. 이 기능은 광학적 방법으로 접근할 수 있는 범위 아래로 단백질 제제를 분석할 수 있는 새로운 길을 열었습니다. Archimedes는 다른 방법의 사용을 제한하는 입자의 광학적, 형태적 다양성에 영향을 받지 않습니다. 시료를 희석하지 않고 최대 109 입자수/ml의 고유 농도와 최대 100cP의 점성도를 다루며 깨지기 쉬운 응집체를 건드리지 않습니다. 콤팩트한 유체 센서는 100µL의 시료만 있으면 됩니다. 농도는 각 응집체가 집계된 후에 하나씩 직접 측정됩니다.
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Archimedes의 측정 원리를 그림 1에 나타내었습니다. 응집체나 기타 입자는 현탁액 상태로, 알려진 주파수로 기계적 공명하는 MEMS(미세 전자 기계 시스템) 기반 미세유체 채널을 흘러갑니다. 응집체가 존재하여 질량이 추가되면 센서의 공명 주파수가 이동합니다. 이러한 주파수 이동이 측정되어 1 펨토그램(10-15g)의 분해능으로 응집체 질량이 측정됩니다. 이렇게 질량을 측정하여 응집체 질량과 크기의 통계가 생성됩니다. 각 응집체의 질량을 등가 구형 직경으로 변환하여 해당하는 크기 분포를 도출합니다.
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그림 2 (a) 는 4µL의 제제 완충액에 혼합된 1마이크론 미만 IgG 단백질 응집체의 크기 분포입니다. 측정된 농도는 크기가 300nm를 초과하는 경우에 4x106 응집체/mL입니다. 기본적으로 질량을 측정하기 때문에 그림 2(b)처럼 각 응집체를 구성하는 (질량이 알려진) 단백질 분자 수로 분포를 표시할 수 있습니다.
Archimedes는 수많은 대형 생명공학기업에서 치료 단백질 제제를 분석하는 데 사용되어 왔습니다. 크기 범위가 300nm - 1µm인 응집체의 농도를 보여주는 그림 2 (c)처럼 Archimedes는 광범위한 시료를 측정할 수 있습니다. 일련의 시료에서 이 크기의 응집체가 10배 증가한 것으로보아 대략적으로 점진적 응집이 일어나는 것에 해당합니다. 1마이크론 미만 응집체의 농도는 제제 품질과도 상관관계가 있습니다.
또한 Archimedes는 오염 물질과 단백질 응집체를 명확히 구분할 수 있습니다. 예를 들면 그림 3에서 밀도가 현탁 완충액보다 큰 응집체는 음의 피크를 생성합니다. 양의 피크도 보이는데 이것은 실리콘 오일 방울에 의한 것으로 오일 방울은 완충액보다 밀도가 낮기 때문에 오일 방울이 존재하면 센서의 전체 질량은 실제적으로 감소하고 센서의 공명 주파수는 증가합니다. 이러한 부호 차이를 통해 Archimedes는 응집체와 오일 방울을 구분하고 그림 3처럼 각 성분의 분포를 생성할 수 있습니다.
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Archimedes를 사용한 연구 결과 바이오약제에는 취급, 저장 중에 포장에서 나온 걸러질 수 있는 상당한 성분이 있었습니다. 그림 4를 보면 포장재 유형과 수명에 따라 10억분율 단위로 직경 400nm 미만 오일 방울 성분 총량이 증가합니다.
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또 다른 연구를 나타낸 그림 5에서는 플라스틱 포장에 담긴 바이오치료제를 시간 경과에 따라 교반하고 주기적으로 시료를 채취했습니다. 오일 액적 물질에서 중요한 성장 검출 교반 시간 이러한 여과 물의 존재 및 응집의 형성 사이의 상관 관계도 평가 가능합니다.
아르키메데스는 작은 서브 마이크론 영역의 단백질 제제 연구에 새 장을 열고 있습니다. 개발 및 제조 공정 초기에 제제의 품질과 안정성에 관한, 따라서 잠재적으로는 제제의 안전성과 효능에 관한 귀중한 정량적 정보를 제공할 수 있습니다.
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