동적 광산란법 소개

서론

동적광산란(PCS-Photon Correlation Spectroscopy(광자산란분광학) 혹은 QLS-Quasi-Elastic Light Scattering(준탄성광산란))은 서브마이크론 영역의 입자 사이즈를 측정하는 테크닉이다. DLS(Dynamic Light Scattering)는 입자의 사이즈와 관련된 브라운운동을 측정한다.

브라운 운동

DLS(Dynamic Light Scattering) 는 입자의 사이즈와 관련된 브라운운동을 측정한다. 브라운운동은 랜덤한 움직임으로 용매분자와 그 주위에 있는 입자와의 출동 때문에 생기는 충격이다. 일반적으로 DLS 는 액체에 떠있는 입자의 측정과 관계되는 것이다. 큰 입자는 더 느린 브라운 운동을 보일 것이다. 작은 입자는 용매입자에 의해 멀리 움직이게 되고 더 빨리움직인다. 정확한 온도는 DLS 의 측정에 꼭 필요한데 이는 점도에 관한 정보가 필요하기 때문이다 (왜냐하면 용액의 점도는 온도의 함수이기 때문이다 ). 온도는 안정 되야 하는데 그렇지 않으면 샘플 내의 흐름이 랜덤하게 움직이지 않으며 사이즈의 정확한 해석을 방해할 것이다.

브라운운동의 속도는 병진확산계수 (translational diffusion coefficient, D)로 정의된다.

수력학적 지름

입자의 사이즈는 Stokes-Einstein 식에

의한 병진확산계수로 계산된다 ;

여기서

d(H) = hydrodynamic diameter

D = translational diffusion coefficient

k = Boltzmann's constant

T = absolute temperature

η = viscosity

지름은 DLS 에 의해서 측정된 것이고 용액내의 입자확산에 관련된 것이기 때문에 유체역학적 지름이다. 이 기술로 얻은 지름은 입자의 병진확산운동과 같다.

병진확산운동은 입자 "코어"의 사이즈에만 의존하는 것이 아니고 매질 안에서의 표면구조 , 농도및 이온의 타입에 의존한다. 입자의 확산 속도에 관여하는 인자는 다음 절에서 논의하겠다.

분산매의 이온강도

매질 내의 총이온농도는 전자이중층의 두께(Debye length (K^-1)) 의 변화로 인한 입자확산속도에 영향을 미친다. 그러므로 낮은 유전체 매질은 입자주변에 확장된 이중층을 가지기 때문에 확산 속도가 저하되고 크고 명백한 유체역학적 지름을 가진다. 반대로, 높은 전도성 미디어 측정시에는 유체 역학적 직경을 감소되어 전기 이중층이 표시되지 않습니다.

DLS 의 기능은 일반적으로 폴리스타이렌 라텍스를 스탠다드 물질로 사용한다. 만약에 스탠다드 물질을 측정 전에 희석해야 하면 적당한 매질에 희석 시키는 것이 중요하다. DLS 의 국제규격(ISO 13321 Part 8 1996) 은 폴리스타이렌 표준물질은 10 mM 의 염화나트륨에서 만들어져야 한다. 이러한 염의 농도는 전자이중층의 생성을 막고 유체역학적 지름이 공증된 유체역학적 지름이나 예상했던 유체역학적 지름과 동일하게 된다. 60nm 단분산 라텍스로 10mM NaCl 보다 탈염수에 분산하였을 때 15% 이상 크다는 결과가 나온다.

표면 구조

입자의 표면에서 일어나는 변화는 확산속도에 영향을 미치게 되고 이는 입자의 겉보기 사이즈의 변화와 일치한다. 흡수된 고분자 층은매질로 나가게 되고 표면에 평평하게 퍼져있는 고분자보다 확산 속도가 감소할 것이다. 표면과 고분자의 특성은 매질의 이온농도가 고분자의 형태에 영향을 미치듯이 몇 나노미터 정도의 사이즈 변화를 야기한다 .

비-구형 입자

모든 입자사이즈 측정기술은 비구형 입자의 사이즈를 기술하는데 근본적인 문제를 가지고 있다. 구형은하나의 형태로 명백하게 표현되는 유일한 물질이다.

 다른 측정기술은 각각 다른 입자의 물성이 측정되는데 예를 들어 추출되는 영역 , 밀도, 산란강도에 따라서 평균사이즈와 사이즈 분포가 달라진다. 현미경으로 촬영한 사이즈도 대비값의 설정에 따라 달라지기도 한다 . 이러한 결과들이 모두 고유의 "정답"은 아니라는 것을 이해하는 것이 중요하다.

비구형 입자의 유체역학적 지름은 구형의 지름은 같은 병진확산속도를 가지는 구형입자의 지름이다.

만약에 입자의 모양이 변하여 확산속도에 영향을 미치면 열역학적 사이즈는 변할 것이다. 예를 들어 막대형태의 입자 길이가 작게 변화하면 바로 사이즈에 영향을 미치는 반면에 확산속도에 지대한 영향을 미치는 지름의변화는 감지하지 못할 것이다.

단백질과 거대분자의 형태는 일반적으로 확산매질의 성질에 정확하게 의존한다. 형태의 변화는 확산속도에 영향을 미치기 때문에 DLS 는 이러한 변화를 검출하는 민감한 기술이다.

광산란 이론

Rayleigh 산란

만약에 입자사이즈가 분석에 사용된 레이저보다 파장 (일반적으로 d=λ/10 보다 작거나 60 nm 의 헬륨네온 레이저를 사용한다.) 이 작으면 수직 편광 레이저에 의한 입자노출 때문에 산란이 일어나게 되고 명확하게 모든 방향에서 등방성을 나타내게 될 것이다

레일리의 접근은 I 는 d 의 6 제곱에 비례하고 λ의 4 제곱에 반비례 한다는 것을 보여준다. I 는 광산란의 강도이고 d 는 입자의 지름, λ는 파장을 나타낸다. d 의 6 제곱은 50nm 의 입자는 5 nm 입자에 비해 10 의 6 제곱 혹은 백만 배로밝게 산란이 일어난다. 따라서 큰 입자에서 나오는 빛은 약한 입자에서 나오는 빛을 감쇠시키는 위험이 있다. 이러한 d 의 6 제곱 인자는 DLS 에서도 측정이 어렵다는 것을 말해주는데 예를 들어 1000 nm 입자와 10 nm 입자의 혼합물에서의 총산란 분포는 극히 작을 것이다. 높은 산란강도와 관련된 λ의4 제곱의 역수 관계는 레이저의 파장을 감소시킴에 따라 얻어졌다.

Mie 이론

입자의 사이즈가 적당하게 광의 파장과 평행을 이루면 각도와 밀접하게 관계된 최대와 최소의 복합적인 함수가 관찰된다.

Fig 1 에 173 도(수용액에서 Zetasizer Nano S 와 Nano ZS 에서 검출한 각도)와 90 도(Nano S90 과 Nano ZS90 에서 검출한 각도 )에서의 산란강도와 입자사이즈의 이론적인 그림을 나타내었다. 633nm 파장의 레이저를 사용하였고 1.59 의 실수 굴절률과 0.001 의 허수 굴절률의 조건에서 측정하였다 (실수 값은 입자의 굴절률에 관한 값이고 , 허수는 흡수(absorption) 에 관한 값이다). Mie 이론은 강도그래프에서 최대값과 최소값을 정확하게 정의할 수 있는 유일한 이론이고 모든 파장 , 사이즈, 각도에 대해 명확한 해답을 얻을 수 있다. Mie 이론은 Nano 소프트웨어 에서 강도의 분포를 부피로 바꿔준다.

Figure 1: Theoretical plot of the log of the relative intensity of scattering versus particle size at angles of 173° (Nano S, and Nano ZS in aqueous media) and 90° (Nano S90 and Nano ZS90) assuming a laser beam with wavelength of 633nm, real RI 1.59 and imaginary RI 0.001

동적 광산란법의 원리

DLS 는 브라운 운동에 의한 입자의 확산속도를 측정한다. 이는 요동하는 광산란의 속도를 알맞은 광학배열을 사용하여 측정한다. 어떻게 이러한 광산란의 요동이 발생하는 것일까?

움직이지 않는 입자가 있는 Cuvette(크기와 광학적 성질에관해 올바르게 정해진 특징을 지니는 유리용기)은 레이저에 의해 노출되고 불투명한 유리스크린은 샘플 셀을 확인하는데 사용한다. 일반적으로 반점이 있는 패턴을 볼 수 있다 (Fig 2). 이러한 반점은 시스템자체를 움직이지 않는 입자로 가정했기 때문에 사이즈와 위치가 변하지 않는다. 어두운 공간은 산란된 빛이 엇갈려 만나는 곳이고 서로 상반되어결국 상쇠 된다 (Fig 3A). 반점 패턴에서 밝은 얼룩은 산란된 빛이 동일하게 들어와서 간섭이 일어나 밝은 색을 띠게 된다 (Fig 3B).

Figure 2: Schematic representation of a speckle pattern

Figure 3: The observed signal depends on the phase addition of the scattered light falling on the detector. In A, two beams are in opposite phase and 'cancel each other out' resulting in zero intensity detected. In B, the two beams are in phase and 'enhance each other' resulting in a sum of the intensity detected.

시스템 내의 입자가 브라운운동 하에 있을 때 반점패턴은 일정한 모션을 보이는 것을 알 수 있다. 이것은 움직이는 입자에 의한 상의 중첩이 일정하게 나타나고 새로운 패턴을 형성하기 때문이다. 이러한 강도의 변동이 일어나는 속도는 입자의 사이즈에 의존한다. Fig 4 에 디스퍼전 내의 큰 입자와 작은 입자에서 발생하는 전형적인 강도의 변동을 나타내었다. 작은 입자는 큰입자보다 강도의 변동을 더 빠르게 일으킨다.

Figure 4: Typical intensity fluctuations for large and small particles

입자의 브라운 운동에 의한 주파수 스펙트럼을 직접적으로 측정할 수 있지만 그렇게 하는 것은 비능률적이다. 최상의 분석방법은 digital auto correlator 라고 부르는 장비를 사용하는 것이다.

Correlator 의 원리

correlator 는 기본적으로 신호를 비교하는 것이다. 두 개의 신호 사이의 유사성 정도를 측정하도록 디자인 되어 있거나 하나의 신호가 스스로 시간인터벌을 바꾸는 장비이다.

만약에 신호의 강도를 특정시간과 특정시간 후에 신호자체와 비교하면 어떠한 신호도 서로 상관관계를 가지지 못할 것이다.

초기의 신호강도에 대한 정보로는 무한대 시간의 결과를 예측 하지 못한다. 이러한 현상은 확산 같은 랜덤 프로세스에서 흔히 볼 수 있다. 그러나 시간 t 에서의 신호강도를 매우 작은 시간텀 (t+dt)과 비교하면 강한 연관성이나 상호관계를 찾을 수 있다. 이러한 두 개의 신호는 강하고 좋은 연관성을 나타낸다.

Figure 5: Schematic showing the fluctuation in the intensity of scattered light as a function of time

브라운 운동 같은 랜덤 프로세스에서 시간 t 에서의 시그날은 t+2dt 의 시간에서의 시그날을 비교하면 상호 연관성을 가지지만 t+dt 만큼 좋은 상호 연관성을 가지지는 않는다.

이러한 상호 연관성은 시간이 감소함에 따라 감소한다 . dt 라는 시간 간격은 매우 작아서 나노세컨드나 마이크로 세컨드의 범위를 가지고 이를 correlator 의 샘플시간이라고 부른다. 시간 t 에서의 신호의 강도와 본래의 시간을 같은 시간에 비교하면 완벽하게 동일한 상호연관성을 가진다.

완벽한 연관성을 보이는 것을 unity(1) 라고 하고 연관성이 없으면 zero(0)이라고 한다 만약에 t+2dt, t+3dt, t+4dt 등의 시간을 시간 t 의 시그날과 비교하면 랜덤한 형태에서 비롯된 시그날 과의 연관성은 감소 할 것이고 극단적으로 무한대의 시간에서는 아무런 연관성을 같지 않을 것이다

만약에 큰 입자의 시그날 이라면 시그날 자체가 천천히 바뀔 것이고 연관성도 오랫동안 유지될 것이다 (Fig 6). 만약에 입자가 작고 빠르게 움직인다면 연관성은 더욱 빨리 감소할 것이다 (Fig 7).

상관도를 보면 샘플에 대해 많은 정보를 얻을 수 있다 .

Figure 6: Typical correlogram from a sample containing large particles in which the correlation of the signal takes milliseconds to decay

Figure 7: Typical correlogram from a sample containing small particles in which the correlation of the signal decays over 10's of microseconds

그래프가 시작되자마자 두드러지게 감소하는 것을 볼 수 있는데 이는 샘플의 평균 사이즈를 의미한다. 급격한 선의 변화는 샘플이 단분산에 가깝다는 것을 의미한다. 반대로 말하면 그래프가 넓은 폭으로 감소하면 다분산 샘플이라는 것을 확인할 수 있다.

상관함수

디스퍼전 내의 입자는 일정하고 랜덤 브라운 운동을 하기 때문에 시간의 함수에서 광산란의 강도가 요동치는 것을 알 수 있다. PCS 장비에서 쓰인 correlator 는 산란된 강도에 대해 G(τ)라는 상관함수를나타낸다 :

G(τ) = <I(t).I(t+τ)>
τ = 는 correlator 의 시간차이 (같은샘플)를 나타낸다 .

브라운 운동을 하는 많은 수의단분산 입자의 상관함수는 t 에 대해 지수감소 함수([G])의 형태를 나타낸다 :

 G(τ) = A[1 + B exp(-2Γτ)]

A 는 상관 함수의 베이스라인이고 B 는 상관함수의 절편이다 .

Γ = Dq²

D 는 병진확산계수이다.

q = (4 π n / λ₀) sin (θ/2)

n 은 분산제의 refractive index 이고 λo 는 레이저의 파장은 산란각을 의미한다.

다분산일 경우에는 다음과 같은 식으로 정의 할수 있다:

 G(τ) = A[1 + B g₁(τ)²]

g₁ 은 상관함수내에서의 모든 지수적 감소의 총합을 나타낸다 .

상관함수로 부터 얻어진 입도정보

Size is obtained 다양한 알고리즘에 의한 상관함수를 이용하여 사이즈를 얻었다. 두 가지로 접근할 수있는데 첫 번째는 한 개의 지수함수로 나타낼 수 있고 나머지는 두 번째는 복합적인 지수함수로 나타낼 수 있다 . 한 개의 지수함수로 나타나는 것은 평균사이즈(z-average)와 다분산 인덱스와 관련된 분포의 폭을 기반으로 한다 . 복합적인 함수로 나타나는 것은 입자 사이즈의 분포(비음최소자승법-Non-negative least squares (NNLS)) 혹은 CONTIN 으로나타난다.

광산란의 강도를 통해 얻은 분포강도는 다양한 사이즈를 분류할 수 있기 때문에 사이즈분포강도라고도 할 수 있다 .

강도에 의한 분포가 하나의 부드러운 피크를 보이면 부피분포로 전환하게 되면 Mie 이론을 적용한다 .

광학 파라미터가 적절하다면 약간 다른 모양의 피크로 보일 것이다 .

그러나 잔피크 들이 많거나 하나의 피크가 아니라면 Mie 이론을 사용하여 refractive index 와 관련된 파라미터를 입력하여 강도 분포를 부피분포로 바꿀 수 있다. 이는 잔피크나 2 번째 피크의 중요도를 실제적으로 확인할 수 있게 해준다. 일반적으로

d(강도)>d(부피)>d(개수) 순으로 나타내어 진다 .

강도, 부피, 개수의 분포의 차이점을 가장 간단하게나타낼 수 있는것은 같은 개수의 5nm 와 50nm 의 지름을 가지는 두 개의 구형입자를 비교하는 것이다(Fig 8). 이 두 가지 분포가 그래프에 나타나면 5 와 50nm 위치에 1:1 의 비로 피크가 보일 것이다. 이러한 개수분포를 볼륨분포로 전환하게 되면 두 개의 피크는 1:1000 의 비율로 바뀌게 된다(왜냐하면 구의 부피는 4/3π(d/2)³)이기 때문이다). 여기에 강도의 분포를 고려해 보면 1:100000 의 비로 바뀌게 될 것이다. (왜냐하면 강도분포는 d6 에 비례하기 때문이다 -레일리의 접근법 ).

DLS 에서 얻어지는 분포의 값은 강도를 측정한다는 것을 기억하자.

Figure 8: Number, volume and intensity distributions of a bimodal mixture of 5 and 50nm lattices present in equal numbers

동적 광산란 기기의 광학적 배열

A 대표적인 DLS 시스템은 다음의 6 가지로 구성되어있다 . 첫번째로 레이저 소스 1가셀 2로 통과하는 부분이 있다. 희박용액인 경우 대부분의 레이저가 샘플을 통과하지만 몇몇 입자들은 산란을 일으킨다. 검출기3는 이렇게 산란된 빛을 측정한다. Zetasizer Nano 시리즈의 검출위치는 173 도와 90 도 이다.

Figure 9: Optical configurations of the Zetasizer Nano series for dynamic light scattering measurements

산란된 빛의 강도는 특정한 범위 내에서 검출되어야 성공적으로 측정할 수 있다. 만약에 강도가 너무세다면 포화될 것이다. 이것을 극복하기 위하여 감쇠기 4를 사용하는데 이는 레이저 소스 자체의 강도를 줄여주어 산란된 빛의 강도가 감소하도록 해준다. 작은 입자나 희박용액처럼 충분히 산란되지 않는 샘플의 경우는 레이저 소스의 강도가 증가한다. 이러한 경우 감쇠기는 더 많은 레이저가 샘플을 통과하게 할 것이다.

큰 입자를 가지거나 고농도의 샘플에서 많은 산란이 일어나는 경우 레이저 소스가 감소할 것이다. 검출기의 적절한 위치는 Nano software 에서 자동으로 결정되어 100~0.0003% 범위까지 가능하다.

산란된 시그날의 강도는 corelator 라고 하는 디지털 보드에 보내진다. corelator 에서 알맞은 시간간격으로 강도의 변화를 비교한다. corelator 에서 획득한 정보는 컴퓨터로 보내지고 Nano software 에서 분석 및 사이즈 정보를 나타낸다.

Zetasizer Nano 만의 특징

비침투성 후방산란 검출 (NIBS)

Nano S 와 Nano ZS 장비는 173 도에서 산란정보를 검출한다. 이것이 후방산란 검출이다. 또한, 광학기기들은 시료와 접촉 상태에 있지 않으며 따라서 검출 기기를 비 침투적이라 말합니다. 게다가 광학장비가 샘플에 직접 접촉하는 것이 아니기 때문에 이러한 광학접근은 비침습적이다.

• 이러한 비침습적 후방산란은 다음의 몇 가지 장점이 있다. 레이저는 샘플의 모든 부분을 지나지 않음으로써 입자에 의해 산란된 빛이 다른 입자를 산란시키는 다중산란을 방지해 준다. 빛이 샘플의 최소거리로 지나가기 때문에 고농도의 샘플도 측정이 가능하다.
• 디스퍼전 내의 오염 입자는 일반 샘플의 사이즈보다 크게 측정된다. 큰 입자는 대부분앞쪽에서 검출된다. 따라서 후방산란법은 이러한 오염입자들의 효과를 줄여준다.

입도를 위한 다양한 측정 위치 선정

Nano S 와 Nano ZS 장비 내의 Cuvette 의 위치는 바뀔 수있다. 이러한 측정 위치의 변화는 초점렌즈에 의해 움직이고 Nano software 에 의해 자동으로 결정된다(Fig 10).

Figure 10: Schematic diagram showing the measurement position for (a) small, weakly scattering samples and for (b) concentrated, opaque samples. The change in measurement position is achieved by moving the focusing lens

작은 입자나 희박용액일 경우 디스퍼전 내로 산란되는 양을최대로 하기에 유용하다. Cuvette 의 벽으로 레이저가 통과하면 레이저는 섬광을 일으킬 것이다.

 이러한 섬광은 입자 산란에 의한 시그날을 제거할 것이다. 측정하는 위치를 Cuvette 의 벽쪽에서 중심으로 이동하여 이러한 효과를 없애줄 것이다 (Fig 10a).

큰 입자나 고농도의 샘플은 더많은 빛을 산란한다. 이러한 경우는 Cuvette 의 벽에 가까운 곳으로 접근하여 측정 함으로써 이러한 다중산란을 줄여준다. 이는 빛이 통과하는 길이를 최소한으로 줄이는 것이다(Fig 10b). 측정 위치는 상관함수와 빛의 산란 강도의 조합으로 자동적으로 결정된다.

참고문헌

[1] International Standard ISO22412:2008  Particle Size Analysis, Dynamic Light Scattering (DLS)

[2] Dahneke, B.E. (ed) Measurement of Suspended Particles by Quasi-elastic Light Scattering, Wiley, 1983.

[3] Pecora, R. Dynamic Light Scattering: Applications of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press, 1985.

[4] Washington, C. Particle Size Analysis In Pharmaceutics And Other Industries: Theory And Practice, Ellis Horwood, England, 1992.

[5] Johnson, C.S. Jr. and Gabriel, D.A. Laser Light Scattering, Dover Publications, Inc., New York 1981