Lentivirus 보관 조건 최적화: Zetasizer Advance Ultra와 NanoSight Pro를 활용

소개

렌티바이러스는 유전자 치료법 개발에 널리 사용되는 바이러스 벡터입니다. 렌티바이러스는 다른 바이러스 및 비바이러스 벡터 기반 유전자 치료법과 비교하여 몇 가지 장점이 있습니다. 여기에는 대상 세포로 큰 유전자나 여러 개의 유전자를 운반하고, 분할 세포와 비분할 세포를 감염시키고, 이식 유전자를 숙주 세포 게놈에 통합시키는 기능이 포함됩니다.¹

그러나 이러한 바람직한 렌티바이러스 벡터 특성에는 아데노 연관 바이러스(AAV)와 같은 다른 일반적인 바이러스 벡터에 비해 더 복잡한 구조가 필요합니다. 렌티바이러스는 직경이 90~130nm인 외피형 구형 바이러스이며 이식 유전자, 뉴클레오캡시드, 캡시드, 외피 및 표면 막 단백질을 비롯한 여러 성분으로 구성됩니다.²

렌티바이러스는 구조가 복잡하기 때문에 안정성, 효능, 보관 조건을 최적화하기 위한 크기 및 역가 등의 특성을 측정하는 분석에서 어려움이 발생합니다. 서로 다른 보관 조건에서 렌티바이러스 트랜스펙션 및 기능적 역가 분석을 수행하면 매우 다른 결과가 나올 수 있습니다. 이는 렌티바이러스 구조에 대한 콜로이드 및 형태학적 변화가 유전자 치료 벡터로서의 효능에 유의한 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.

이 응용 노트에서는 실온, 얼음 위, 고염 완충액 및 세 번의 동결-해동 사이클 후에 보관된 렌티바이러스에 대한 Zetasizer Ultra 및 NanoSight Pro 크기, 다분산성 및 바이러스 입자 역가 결과를 제시합니다.

NanoSight는 나노입자 크기와 농도를 측정하기 위해 나노 입자 추적 분석(NTA)³을 활용합니다. 입자 크기는 여러 개별 입자의 평균 제곱 변위를 정량화하여 결정합니다. 바이러스 입자 역가는 알려진 부피의 바이러스 입자 수를 계산하여 계산합니다. NTA 크기와 농도 측정은 동시에 이루어지며 샘플당 약 5분이 소요됩니다.

Zetasizer Ultra Red는 동적 광 산란(DLS)⁴을 사용하여 입자 크기를 측정하고 다각도 동적 광 산란(MADLS)⁵을 사용하여 고분해능 크기와 입자 농도를 측정합니다.⁶ 바이러스 입자 역가는 측정된 MADLS 크기, 물질 산란율, 물질 굴절률, 분산제 점도 및 굴절률을 통해 계산합니다.

실험방법

초정제 렌티바이러스 샘플은 PLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A>mCherry 벡터로 생산되었으며, Vector Builder에서 구입했습니다.

Zetasizer Ultra 크기 및 농도 측정은 20마이크로리터의 갓 해동된 샘플을 BSL-2 후드 내부의 ZEN2112 석영 큐벳으로 직접 피펫팅하여 순 렌티바이러스 샘플에서 수행되었습니다. 연속적인 희석은 후드의 질량 균형을 사용하여 중량 측정법으로 수행되었습니다. 큐벳 뚜껑을 닫은 후 측정을 시작하기 전에 인접한 벤치에 위치한 Zetasizer Ultra 기기로 운반했습니다. 모든 샘플 처리는 BSL-2 후드 안에서 수행되었습니다.

NanoSight Pro 측정은 NS Xplorer 소프트웨어 버전 1.1을 사용하는 NanoSight Pro를 사용하여 분석 직전에 샘플을 HBSS 완충액으로 1000x 희석하여 수행되었습니다. 샘플은 자동 카메라 설정을 사용하여 측정되었습니다. NanoSight Pro 기기의 작동을 포함하여 모든 샘플 전처리 및 측정은 BSL-2 후드 내부에서 수행되었습니다.

실온에서 HBSS 완충액에 보관된 렌티바이러스는 0, 1, 4, 24, 48시간 시점에서 측정되었습니다. 4°C에서 HBSS 완충액에 보관된 렌티바이러스는 0, 2, 3, 8일 시점에서 측정되었습니다. HBSS 완충액에서 렌티바이러스는 0, 1, 2, 3회의 동결-해동 사이클 후에 측정되었습니다. 4°C에서 고염분 완충액 5M NaCl의 렌티바이러스를 0, 1, 3, 8일 시점에서 측정하였습니다.

결과 및 고찰

갓 해동된 렌티바이러스 크기는 Zetasizer Advance Ultra와 NanoSight Pro를 모두 사용하여 측정되었습니다(그림 1). 이러한 결과는 나노 입자 크기를 측정하기 위한 두 기술의 상대적 강점과 약점을 강조합니다.

NTA는 고도로 희석된 샘플의 고분해능, 수 가중 입자 크기 분포를 생성하는 집계 기반 기술입니다. 단일 각도 DLS는 순 샘플의 강도 가중 및 저분해능 입자 크기를 생성하는 총체적인 기법입니다. NTA 결과는 평균적으로 더 작으며, 123nm에서 더 풍부하고 작은 렌티바이러스 피크에 높은 가중치를 부여하고 300nm에서 응집체의 피크가 비례적으로 작습니다. 반면 186nm에서 더 넓은 DLS 피크는 더 많은 빛을 산란시키는 더 큰 응집체에 더 가중치를 둡니다. DLS는 495nm에서 NTA가 검출하기에는 너무 미량인 응집체를 검출할 수 있는 감도를 가지고 있습니다.

DLS와 NTA 기술을 함께 사용하면 나노 입자 크기의 완전한 분석 특성을 서로 보완하면서 제공할 수 있습니다.

도표 1: 갓 해동된 렌티바이러스에 대한 Zetasizer Advance Ultra 및 NanoSight Pro 입자 크기 분포 결과.

실온 안정성 결과, 실온에서 1시간 동안만 보관해도 렌티바이러스 콜로이드 안정성에 유의한 변화가 나타났습니다(그림 2). Zetasizer와 NanoSight 결과 모두에서 해동 후에 1시간 이상 측정한 크기 및 농도에 대해 렌티바이러스 샘플에 유의한 변화가 일어났습니다.

도표 2: Zetasizer Advance Ultra 및 NanoSight Pro의 렌티바이러스 실온 안정성 결과.

4°C HBSS 완충액에서 얼음에 보관된 렌티바이러스는 실온 보관에 비해 안정성이 개선된 것으로 나타났습니다(도표 3). 그러나 이러한 보다 안정적인 보관 조건에서도 1~2일 사이에 두 기술 모두에서 유의한 변화가 관찰되었습니다. Zetasizer 결과에서는 렌티바이러스 역가가 0~2일까지 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다. 반면, NanoSight Pro 결과는 0일에서 1~3일까지 총 바이러스 입자 역가가 증가한 것으로 나타났습니다. 이 두 가지 변화는 하루 동안 보관한 샘플이 불안정하다는 것을 나타냅니다. 또는 너무 부드럽게 혼합하면 가역적 응집체가 분해되지 않고 지나치게 격렬하게 혼합하면 불안정해질 수 있으므로 적절한 샘플 혼합은 최적화에 똑같이 중요할 수 있습니다.

도표 3: Zetasizer Advance Ultra 및 NanoSight Pro의 4°C HBSS 완충액에서의 렌티바이러스 안정성 결과.

렌티바이러스 안정성에 동결-해동 사이클이 미치는 효과는 Zetasizer 및 NanoSight Pro를 사용한 측정을 통해 밝혀졌습니다(도표 4). Zetasizer의 강도 가중 결과에서 바이러스 입자 역가가 0~1사이클로 유의하게 감소했으며 1, 2, 3회 냉동-해동 사이클에서 Z 평균 크기가 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. NanoSight Pro 수 가중 크기 및 농도 결과는 렌티바이러스 샘플 간의 변화에 덜 민감했으며, 이는 렌티바이러스 단량체가 동결-해동 사이클의 불안정성에 더 잘 저항한다는 것을 나타냅니다. 

샘플은 공급업체로부터 냉동 상태로 배송 및 수령한 후 즉시 액체 질소에 보관했다는 점에 유의해야 합니다. 냉동-해동 연구의 경우, "0 냉동-해동 시점" 이전에 샘플을 해동하고 나누었습니다.

도표 4: Zetasizer Advance Ultra 및 NanoSight Pro의 HBSS에서의 3 냉동-해동 사이클 렌티바이러스 안정성 결과.

해동된 렌티바이러스를 4°C에서 5M NaCl 용액에 보관하여 높은 염분 조건에서 렌티바이러스의 안정성은 연구했습니다(도표 5). Zetasizer Z-avg 결과에서 이틀에 걸쳐 평균 크기가 156nm에서 1.4마이크론으로 크게 증가했습니다. NanoSight Pro 결과에서는 8일 동안 입자 크기가 120nm에서 105nm로 소폭이지만 꾸준히 감소했습니다.

이 두 기술의 크기 및 농도 결과의 차이는 두 가지 다른 측정 원리의 결과에 대한 기본 가중치 때문일 수 있습니다. DLS는 본질적으로 낮은 분해능과 강도 가중 결과를 가지며 응집체에 더 민감합니다. NTA는 수 가중치가 적용되고 분해능이 높으며 응집에 따른 변화에 훨씬 덜 민감합니다. 이러한 차이점은 보완적인 특성 분석의 중요성을 강조합니다.

또한 높은 염분 조건은 동일했지만 측정된 농도는 두 기술 사이에서 1,000x 차이가 났습니다. Zetasizer에 의해 희석되지 않고 측정된 고농도 렌티바이러스 샘플에는 NanoSight Pro를 위해 1,000x로 희석된 샘플과는 다른 안정성 프로파일이 있을 수 있습니다.

도표 5: Zetasizer Advance Ultra 및 NanoSight Pro의 고염분 5M NaCl 완충액에서의 렌티바이러스 안정성 결과.

결론

Zetasizer Ultra와 NanoSight Pro는 모두 다양한 보관 조건에서 렌티바이러스를 성공적으로 측정할 수 있었습니다. 결과에 따르면 렌티바이러스 샘플을 냉동 보관하고 해동한 다음 얼음에 하루 미만 동안 보관한 다음 분석해야 합니다. 또한 해동된 렌티바이러스 분취 샘플의 혼합 과정 최적화가 감염성 역가 및 입자 콜로이드 안정성에 영향을 미치는 중요한 요인일 수 있습니다.

이 결과는 기능적 감염 분석 외에도 여러 보완적인 기술을 사용하여 두 벡터 나노 입자 특성 분석을 수행하는 것이 중요하다는 점을 강조합니다.

더 자세히 알고 싶으십니까?

• Zetasizer Advance Ultra를 사용하여 렌티바이러스 크기와 역가를 측정하는 방법을 알아보십시오. 자세히 알아보기
• NanoSight와 Zetasizer를 사용하여 렌티바이러스 열 안정성을 연구할 수 있는 방법을 알아보십시오. 자세히 알아보기
  
• NanoSight Pro를 사용하여 렌티바이러스 크기와 역가를 측정하는 방법을 알아보십시오. 자세히 알아보기
  

주요 제품 및 관련 제품

참고 문헌

1. Designing Lentiviral Vectors for Gene Therapy of Genetic Diseases. Viruses. 2021 Aug; 13(8): 1526. doi: 10.3390/v13081526.
2. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 2007, 12: 12.10. doi: 10.1002/0471142905.hg1210s54.
3. ISO 19430:2024(en). Determination of particle size distribution and number concentration by particle tracking analysis (PTA).
4. ISO 22412:2017. Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS)
5. Improved component resolution with Multi-Angle DLS (MADLS). 2018 Malvern Panalytical Application Note.
6. Nanoparticle number concentration measurements by multi-angle dynamic light scattering. J Nanopart Res 22, 108 (2020). https://doi.org/10.1007/s11051-020-04840-8.