동적 광 산란(DLS)은 나노미터 미만에서 수 마이크론까지의 입자나 분자 크기를 해석할 수 있는 능력이 있기 때문에 분산된 입자나 고분자를 특성화하는 강력하고 민감한 기법입니다. 이 민감성은 또한 DLS가 응집 물질을 특성화하는 데 유용한 기법이라는 의미이며, 아주 소량으로도 실행할 수 있기 때문에 많은 응용 분야에서 중요한 역할을 합니다. 하지만 일반적으로 필터 분진, 컬럼 파편, 추적기 응집체, 오염된 실험기의 물질 등과 같은 먼지가 있으면 작은 크기의 입자 측정에 부정적인 영향을 줄 수 있으며 이러한 효과를 억제하는 알고리즘이 존재합니다. 이 응용 참고 자료에서는 DLS 데이터 처리에 대한 새로운 접근 방식을 제시합니다. 이 접근 방식은 소규모 입자에 대한 데이터 편향을 방지하며, 그렇지 않을 경우 손실될 수 있는 응집체의 존재에 대한 심층 정보를 유지하여 응집체의 상대적 존재도와 크기를 추정할 수 있습니다.
동적 광 산란(DLS)은 나노미터 미만에서 수 마이크론까지의 입자나 분자 크기를 해석할 수 있는 능력이 있기 때문에 분산된 입자나 고분자를 특성화하는 강력하고 민감한 기법입니다. 이 민감성은 또한 DLS가 응집체 특성 분석을 위한 유용한 기법이라는 의미이며, 아주 소량으로도 분석할 수 있기 때문에 많은 응용 분야에서 중요한 역할을 합니다.
하지만 일반적으로 필터 분진, 컬럼 파편, 추적기 응집체, 오염된 실험기의 물질 등과 같이 이물질이 존재하는 경우 분석하고 하는 입자 측정에 부정적인 영향을 줄 수 있으며 이러한 효과를 억제하는 알고리즘이 존재합니다.
여기에서는 DLS 데이터 처리에 대한 새로운 접근 방식을 제시합니다. 이 접근 방식은 소량의 입자에 대한 데이터 변형을 방지하며, 그렇지 않을 경우 손실될 수 있는 응집체의 존재에 대한 심층 정보를 수집 분석하여 응집체의 상대적 존재도와 크기를 추정할 수 있습니다.
그림 1: 라이브 데이터에서 응집체의 양상(t >8s)이며, 7.6nm에서 주 피크에 대한 시간 평균 측정값의 정확도를 저하시킬 수 있습니다.
pH4.0 아세트산염 완충액에 분산된 라이소자임(Egg, Sigma-Aldrich)을 Zetasizer Ultra를 이용하여 분석하였습니다. 또한 10mM NaCl에 분산된 NIST 추적 가능 폴리스티렌 라텍스 입자의 혼합 분산 결과를 보여줍니다. 모든 분산물은 200nm로 여과된 탈이온수를 사용하여 준비되었습니다.
검출 체적은 DLS 측정값이며, 장비에 제공되는 시료의 전체 체적보다 훨씬 작습니다. DLS는 스캐닝 전자 현미경(SEM) 및 나노입자 추적 분석(NTA)과 같은 방법보다 통계적으로 유의미한 입자 수를 측정하지만, 측정 중에 개별 입자가 검출 체적 내외부로 확산될 수 있습니다.
이전 응용 참고 자료에서는 적응 상관 DLS 측정에서 일련의 하위 측정 데이터를 정상 상태 및 과도 상태 데이터 집합으로 그룹화하는 방법에 대해 설명했으며, 시료의 검출 체적에 일관되게 존재하는 입자와 검출 체적 내외부로 분산되는 비대표 입자에 대해 설명합니다.
과도 상태 이벤트의 분리는 기본 입자 크기의 정밀도를 개선하지만 과도 상태 데이터를 분석하면 과도 상태 입자도 보다 정확하게 특성화할 수 있습니다.
그림 2에서는 과도 상태 상관 함수와 정상 상태 상관 함수 간에 상관 함수의 차이점을 보여주며, 적용된 분류가 없고 모든 하위 실행 측정값이 함께 평균화되는 경우의 결과도 보여줍니다. 이 측정 내에서 과도 상태 데이터는 시료용으로 수집된 데이터의 작은 일부만을 나타내며 모든 데이터의 평균을 구할 경우 과도 상태 상관 함수의 유의미한 2차 감쇠가 억제됩니다.
그림 2: 라이소자임시료에 대한 자기 상관 함수이며, 정상 상태 데이터, 과도 상태 데이터 및 미분류 데이터(즉, 모든 데이터)에 대한 결과를 보여줍니다.
이러한 억제의 결과와 과도 상태 분류의 이점은 그림 3의 예제 데이터로 더 자세히 알 수 있습니다. 여기에서 분류되지 않은 측정값과 정상 상태 측정값은 모두 3.8nm에서 라이소자임 단량체의 피크 값을 보여주며, 또한 약 100nm에서 응집체의 피크 값을 보여주지만 과도 상태 측정값도 5μm에서 피크 값을 갖는 또 다른 큰 입자가 존재하고 있다는 것을 보여줍니다.
또한 이 데이터는 기본 입자보다 상당히 큰 크기의 응집체가 전체 측정값에서 일관되게 감지되기 때문에 해당 성분을 보고한다는 점에서 적응 상관 관계가 데이터 필터링 알고리즘이 아님을 보여줍니다.
그림 3: 응집된 라이소자임시료에 대한 정상 상태, 과도 상태 및 미분류 입자 크기 분포
모든 DLS 측정에서와 마찬가지로 최적화되지 않은 농도 및 시료의 산란은 입자 크기 데이터의 신뢰성을 제한합니다. 그러나 그림 4에서는 알려진 크기의 입자가 적용된 라텍스 시료에 대해 정확한 크기가 보고되며, 희귀한 대형 입자에 대한 신뢰할 수 있는 속성을 추론하는 데 과도 상태 데이터를 사용할 수 있음을 보여줍니다.
그림 4: 다양한 비율 범위에서 1.6um 라텍스를 적용한 10mM NaCl에 분산된 60nm 라텍스 시료의 강도 가중 입자 크기 분포
시료의 기본 특성과 통계적으로 유의미한 차이를 보이는 하위 실행만 과도 상태로 식별되므로 과도 상태로 분류되는 데이터의 양은 시료마다 달라집니다.
과도 상태 입자의 유의성은 검출 빈도로 평가할 수 있으며 정상 상태 결과에 유지되는 데이터의 양으로 표현됩니다.
표 1: 1mg/ml 라이소자임 시료에 대한 일련의 측정에서 얻은 수치 결과
표 1에 표시된 데이터는 열 부하가 가해진 1mg/ml 라이소자임 시료에 대한 일련의 크기 측정값을 보여줍니다. 모든 측정값은 Z-평균 크기에 대해 유사한 값을 보고하며 정상 상태 데이터에서 단일 피크 크기만 존재하므로 모두 단량체입니다. 정상 상태 결과에 대한 분석에 포함된 하위 실행 비율인 실행 유보율(run retention)은 시간이 지남에 따라 감소하지만 과도 상태 산란체의 검출은 점차 중요해지며 이 분산이 완전하게 안정되지 않음을 보여줍니다. 하지만 여전히 단백질의 단량체 유체역학적 크기는 어느 정도 확신을 갖고 보고할 수 있습니다.
통계적 접근 방식을 사용하여 다수의 하위 측정값으로부터 데이터를 분류함으로써 측정 검출 체적에 일관되게 존재하는 입자의 측정값을 안정적으로 생성할 수 있으며, 따라서 시료를 대표하는 입자와 그렇지 않은 입자를 구분할 수 있습니다. 이 분류는 입도 분석 결과를 왜곡할 수 있는 과도 상태 산란체의 영향 없이 정상 상태 데이터를 보고할 수 있으며, 데이터를 분류하지 않고는 달성할 수 없는 분해능을 사용하여 과도 상태 산란체의 모든 특성을 보고할 수 있다는 의미입니다.
이 과도 상태 데이터의 입도 결과는 알려진 크기의 입자로 도핑된 시료의 측정을 통해 신뢰성이 입증되었습니다. 또한 과도 상태로 분류된 데이터의 비율은 응집체가 정상 상태 결과의 일부가 되도록 다량으로 존재하기 전의 시료의 안정성과 희귀 응집체의 존재 여부에 대한 더 나은 통찰력을 제공합니다.
