관련 생물학적/환경적 노출 조건 하에서 가공 나노물질(MNM)의 특성을 규정하는 요건은 잘 정립되어 있습니다. 이는 입자의 양태 및 거동을 이해하고 궁극적으로 독성 평가에서 사용 가능한 MNM 선량을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 매질 속성의 변화가 입자 거동을 크게 바꿀 수 있습니다. 따라서 복합 매트릭스에서 입자를 특성화할 수 있는 기술이 필요합니다. NTA는 이러한 요구 사항을 충족할 수 있는 수단을 제공하며, 현탁액 속성의 시간적 데이터를 제공하여 관련 생물학적/환경적 매질에서 다양한 입자 유형으로 수행된 일련의 실험을 통해 입증되었습니다.
생물학적/환경적 노출 조건 하에서 가공 나노물질(MNM)의 특성을 규정하는 요건은 잘 정립되어 있습니다. 이는 입자의 양태 및 거동을 이해하고 궁극적으로 독성 평가에서 사용 가능한 MNM 선량을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다1.
매질 속성의 변화가 분산된 이후 입자 거동을 크게 바꿀 수 있으며, 시료 대조 완충액과 비교하여 유기물 함량, pH, 전도도 등에 따라 다양한 입도 분포를 나타냅니다. 이는 생물학적 매질2과 대표 환경 매질3 모두에서 확인되었으며, 이로 인해 복합 매트릭스에서 입자를 특성화할 수 있는 기술이 필요하게 됩니다. 이러한 필요성은 OECD 나노물질 후원 프로그램4의 중요한 종료 지점으로 강조되었습니다.
NTA(나노입자 추적 분석)는 이러한 요구 사항을 충족할 수 있는 대표적인 수단입니다. 다음 응용 참고 자료에서는 EU FP7 기금을 받는 NanoMILE 프로젝트와의 협력 하에 관련 생물학적/환경적 조건에서 입자 선량에 대한 고유한 통찰력을 제공하는 NTA의 능력을 입증한 실험에 대해 설명합니다. 현탁액 속성의 시간적 데이터를 제공하여 관련 생물학적/환경적 매질의 다양한 입자 유형에서 측정이 수행되었습니다.
NTA에서는 현탁액 내 시료의 입자 크기 분포를 확인하기 위해 광 산란과 브라운 운동의 속성을 모두 활용합니다. 시료 챔버에 레이저를 통과시키면 현탁액에서 이 광선의 경로에 있는 입자가 빛을 산란시킵니다. 이 현상은 카메라가 장착된 20배율 현미경으로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 초당 약 30프레임(fps)으로 작동하는 카메라가 약 100μm x 80μm x 10μm의 시야 내에서 브라운 운동을 하는 입자의 이미지 비디오 파일을 캡처합니다(그림 1).
그림 1: NTA에 사용되는 광학 구성 모식도
입자의 움직임이 프레임별로 캡처됩니다. 특허 받은 NTA 소프트웨어가 관찰된 입자 각각의 중심부를 동시에 식별하고 추적하며 XY 평면에서 각 입자의 평균 이동 거리를 측정합니다. 이 값을 이용하여 입자 확산 계수(Dt)를 측정하고 시료 온도(T)와 용매 점도(η)를 알고 있다는 가정 하에 이 값을 스톡스-아인슈타인 방정식(방정식 1)에 대입하여 구형으로 가정한 입자의 유체역학적 직경(d)을 계산할 수 있습니다.
방정식 1: 스톡스-아인슈타인 방정식이며, 여기서 KB는 볼츠만 상수입니다.
NTA는 많은 숫자의 입자를 종합적으로 다루는 총체적 측정 기법이 아니라 입자 하나 하나의 크기를 다른 입자의 크기에 상관없이 개별적으로 측정하는 기법입니다. NTA를 통해 작성된 입도 분포 프로파일이 그림 2에 예로 제시되어 있습니다.
그림 2: NTA를 통해 측정된 입도 분포 프로파일의 예 이 5가지 크기 혼합물은 모달 크기가 약 100nm이며, 약 165nm, 225nm, 300nm 및 400nm의 추가 부분 모집단도 존재합니다.
또한 시료의 산란 체적을 추정해 볼 수 있도록 정해진 관찰 영역 내에서 레이저를 조사하여 입자 운동을 측정하였습니다. 관찰 영역 내에서 입자 농도를 측정하고 더 단위부피 값을 추론함으로써 주어진 모든 크기 수준에 대해서나 전체 체적에 대해 mL당 입자 수 단위의 농도 추정치를 구할 수 있습니다.
NTA가 입자 거동에 대해 고유한 시간 분해 데이터를 제공할 수 있음을 입증하기 위해 NanoSight NS500(HS, 532nm)을 사용하여 일련의 실험을 계획했습니다. 다양한 조건을 대표하도록 설계된 NanoMILE 컨소시엄의 선택 항목을 바탕으로 입자 물질 및 대표 매질을 지정했습니다.
산화 세륨(IV)(33nm, JRCa), 은(100nm, Sigma-Aldrichb) 및 이산화 티탄(70nm, NISTc) 나노입자를 생물학적 조건과 대표 환경 조건을 재현하는 10% 소태아혈청(FBS), 인산완충생리식염수(PBS) 및 제브라피쉬 배아 배지(ZEM)에 분산시켰습니다. 그런 다음 NTA 주사기 펌프를 통해 시료를 공급했고 NTA 스크립팅 기능을 사용하여 21시간 동안 자동화된 방식으로 정기적인 측정을 수행했습니다. 그런 다음 적절한 검출 임계값으로 영상을 처리했습니다.
a. CeO2 - http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/bitstream/JRC89825/lbna26649enn.pdfNTA의 주요 특징은 입자 수를 통해 농도를 제공함으로써 입자 현탁액의 응집률과 침전율을 상관시킬 수 있게 하는 기능입니다.
그림 3 a-d에 표시된 것처럼, 연구 대상으로 사용한 모든 입자 유형은 테스트 매질에 상관없이 21시간 동안 입자 농도의 감소를 보여줍니다. 실험 기간 중 처음 60분 동안 농도가 가장 빠르게 감소했습니다.
그림 3: 21시간 동안 a) 탈이온수, b) 10% FBS, c) PBS 및 d) ZEM에 분산된 CeO2, TiO2 및 Ag MNM의 농도 값을 표시하는 그래프
모달 크기 분포는 그림 4a-d에 표시된 것처럼, 세 가지 입자 유형 모두와 네 가지 매질 조건 모두에서 높은 수준의 변동성을 보였습니다. 당연하게도 가장 큰 크기는 이온 강도가 가장 높은 ZEM의 Ag MNM에서 관찰되었습니다. ZEM에서 TiO2 MNM의 크기는 시간이 지남에 따라 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 시간이 지남에 따라 일부 응집체가 해체되거나 대형 응집체가 침전되면서 분석 영역에서 소형 입자의 비율이 점점 높아졌다는 의미입니다.
그림 4: 21시간 동안 a) 탈이온수, b) 10% FBS, c) PBS 및 d) ZEM에 분산된 CeO2, TiO2 및 Ag MNM의 크기 값을 표시하는 그래프
정량적 농도 측정은 시료의 시각화를 통해 지원됩니다. 그림 5는 각 시점에서 무작위로 선택된 프레임을 보여주며 산란 물질의 감소가 농도 감소로 이어진다는 주장을 뒷받침합니다. 또한 점점 커지는 영상 노이즈는 응집된 대형 산란 입자의 존재를 나타냅니다.
그림 5: 탈이온수, PBS, 10% FBS 및 ZEM에 분산된 CeO2, TiO2 및 Ag 나노입자의 모달 크기 값을 표시하는 그래프 처음 60분 동안의 데이터만 표시되어 있습니다.
종합하면, 그림 3-4에 보고된 농도 및 크기 연구에서는 NTA에 자동화된 루틴을 통해 장기간에 걸쳐 다양한 매질에서 MNM의 거동을 추적 및 모니터링할 수 있는 능력이 있음을 보여줍니다. 농도 및 크기 데이터가 제공되었으며, 이를 사용하면 대표 매질 현탁액에 분산된 입자에 대한 응집 및 시간에 따른 변화를 추적하여 초기 조건을 지난 입자의 양태 및 거동을 이해할 수 있습니다.
NTA는 입자 물질과 무관하게 세 가지 대표 매질 유형 모두에서 입자를 성공적으로 특성화했습니다. 매질 성분으로 인한 산란광은 NTA가 최저 굴절률(Ri)의 입자를 검출하고 추적하는 능력을 제한하지 않는 대신 복합 매질에 포함된 나노물질의 발달과 상호 작용을 도식화했습니다. 입자 거동의 뚜렷한 차이가 모든 조건에서 관찰되었으며, 초기 환경 외부의 입자를 특성화하는 것이 중요하다는 점을 강조하고 있습니다. 이는 선량 추정에 큰 영향을 미칩니다.
침전은 직접적으로 정량화할 수 없지만 시간에 따른 입자의 점진적인 소실을 대형 응집체의 침강으로 특성화할 수 있습니다(그림 5에 정성적으로 표시되어 있음). NTA에서 사용할 수 있는 시간적 분해능과 연계되는 이 데이터의 시간 분해 특성은 관련 매질에 분산된 MNM을 사용한 일반적인 생체 외 시험 과정 동안 MNM 거동을 이해하는 데 있어 중요한 역할을 하며, 선량과 반응의 직접적인 상관 관계를 얻을 수 있는 가능성이 있습니다. 정량적 데이터가 정성적 이미지로 뒷받침되므로 육안 검사를 통해 결과를 확인할 수 있습니다. 또한 그림 5에서 볼 수 있는 것처럼, 시간에 따른 MNM의 비디오 프레임 수를 통해 분산의 안정성 및 발달과 관련하여 몇 가지 중요한 정성적 결론에 도달할 수 있습니다. 이러한 출력을 결합하면 시료 안정성이나 엉김, 응집 또는 침전의 존재를 나타내는 데 유용한 수단이 됩니다. 이 정보는 생체 외 노출에 중요한 영향을 미칠 수 있으며, 나중 시점에 MNM의 대다수가 응집되고 셀 표면에 정착되어 나노급 입자 대신 미크론급 응집체로 흡수될 수 있습니다. 이는 선량-반응과 최적의 생체 외 노출 분석 설계 모두에 대해 실제 노출 선량이 용액에서 유지되는 결과를 초래합니다.
NanoMILE 프로젝트는 계속 발전하여 NTA 자동 샘플러를 포함하게 되었습니다. 이제 NTA에 사용 가능한 자동화된 특성과 대규모 일괄 기능을 통해 관련성을 향상시켜 초기 조건을 넘어선 MNM의 독성학적 영향과 양태/거동을 이해할 수 있습니다.
참고 문헌
[1] Dawson, K, A., Anguissola, S., Lynch, I., (2013) 나노 안전 평가의 생체 내 특성에 대한 필요성: QNano 연구 인프라를 통한 초국가적 액세스 연구를 위한 기금을 받았습니다. Nanotoxicology 7, 346-349.
[2] Moore, T, L., Rodriguez-Lorenzo, L., Hirsch, V., Balog, S., Urban, D., Jud, C., Rothen-Rutishauser, B., Lattuada, M., Petri-Fink, A., 세포 배양 매질의 나노입자 콜로이드 안정성 및 세포 상호 작용에 대한 영향 Chem. Soc. Rev 44, 6287-6305
[3] Tantra, R., Jing, S., Pichaimuthu, S, K., Walker, N., Noble, J., Hackley, V, A., (2011) 생태 독성학 조사에서 나노입자의 분산 안정성: 적절한 측정 수단의 필요성 J Nanopart Res DOI 10.1007/s11051-011-0298-y
[4] http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2010)46&doclanguage=en
이러한 결과로 이어지는 연구는 유럽연합 Seventh Framework 프로그램(FP7/2007-2013)으로부터 자금을 지원받았습니다. 연구비 지급 합의 번호 NMP4-LA-2013-310451
