사용자, 장비 및 사이트간 농도 데이터를 비교할 수 있는 능력은 다양한 응용 분야에서 핵심 요건입니다. NTA 농도 측정 업그레이드의 적용으로 농도 반복성 및 재현성이 크게 향상되었으며 또한 측정에 대해 사용자가 선택한 캡처 및 분석 설정의 영향도 크게 줄어드는 것으로 나타났습니다. 이 응용 노트에서는 다양한 범위의 샘플 크기, 농도 및 시료에서 농도 측정의 정확도 및 정밀도의 개선에 대해 설명합니다.
나노 입자 추적 분석(NTA)은 단일 입도 및 농도 측정값을 제공합니다. 이 기술에 대한 인지도가 점점 증가하면서 사용자 입력 감소, 변동성 감소, 크기 및 농도 측정에서 실험실간 일관성 제공 등의 요건으로 이어졌습니다. NTA 농도 측정은 다양한 크기 및 농도 범위의 나노 입자 유형에 대한 농도 측정 시 개선된 정확도, 정밀도 및 재현성을 제공할 수 있도록 수정이 이루어졌습니다. 농도 측정 반복성 및 재현성은 크게 개선되었으며 NTA 분석을 위해 권장되는 농도 범위에 걸쳐 사용자 설정에 대한 측정 민감도는 감소하였습니다.
NTA에는 현탁액(liquid suspension) 내 샘플의 입도 분포를 확인하기 위해 광 산란과 브라운 운동의 속성을 모두 활용합니다. 샘플 챔버에 레이저를 통과시키면 현탁액에서 이 광선의 경로에 있는 입자가 빛을 산란시켜 카메라가 장착된 20배율 현미경으로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 초당 약 30프레임(fps)으로 작동하는 카메라가 카메라의 관찰 영역 내에서 브라운 운동을 하는 입자의 이미지 비디오 파일을 캡처합니다(그림 1).
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입자의 움직임이 프레임별로 캡처됩니다. 특허 받은 NTA 소프트웨어가 관찰된 입자 각각의 중심부를 동시에 식별하고 추적하며 XY 평면에서 각 입자의 평균 이동 거리를 측정합니다. 이 값을 이용하여 입자 확산 계수(Dt)를 측정하고 샘플 온도(T)와 용매 점도(η)를 알고 있다는 가정 하에 이 값을 스톡스-아인슈타인 방정식(방정식 1)에 대입하여 구형으로 가정한 입자의 유체역학적 직경(d)을 계산할 수 있습니다.
방정식 1 |
여기서 KB는 볼츠만 상수입니다.
NTA는 많은 숫자의 입자를 종합적으로 다루는 총체적 측정 기법이 아니라 입자 하나 하나의 크기를 다른 입자의 크기에 상관없이 개별적으로 측정하는 기법입니다. NTA를 통해 작성된 입도 분포 프로파일이 그림 2에 예로 제시되어 있습니다.
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이 외에도 NTA는 입자별로 측정이 가능하기 때문에 관찰 영역 내 입자의 수도 알 수 있습니다. 표준 NTA 측정에서는 약 10μm의 깊이로 레이저로 조사되는 고정 관찰 영역(약 100μm x 80μm)을 사용하며 이를 통해 샘플의 산란 부피를 추정할 수 있습니다. 새로운 NTA 농도 측정 업그레이드는 캡처 및 농도 결과에 대한 분석 설정의 영향을 모두 줄여주며 더욱 정확하고 정밀하며 반복 가능한 농도 값을 제공합니다.
농도 측정 정확도는 실험실간 정밀도와 마찬가지로 NTA 농도 측정 업그레이드 사용 시 유의미하게 증가하는 것으로 나타났습니다(그림 3). 각각 다른 2곳의 실험실에서 각각 다른 2대의 NS500 장비에 대해 사용자가 선택한 설정에서 동일한 샘플에 대한 분석을 수행하였습니다. NTA 농도 측정 업그레이드를 적용하기 전에는 2곳의 실험실에서 얻은 결과가 특히 더 높은 농도 수준에서 변동성이 매우 컸습니다. 업그레이드를 적용한 후에는 두 실험실간 재현성이 크게 개선되었고 샘플 농도에 대한 측정 정확도도 또한 유의미하게 개선되었습니다.
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또한 NTA 주사기 펌프의 사용은 측정간 변동성을 줄여주면서 입도 및 농도 측정의 반복성을 모두 개선해 주는 것으로 나타났습니다. NTA 주사기 펌프의 사용으로 나타난 개선 사항의 예는 그림 4에 나와 있으며 여기서는 100nm 폴리스티렌 표준 시료 샘플이 동일한 캡처 및 분석 설정에서 정적(주사기 펌프를 사용하지 않음) 또는 흐름(주사기 펌프 사용) 측정을 사용하여 분석되었습니다.
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샘플 전달 및 측정용 프로토콜이 개발되었으며 이는 정밀도 개선에 기여하였습니다. 이렇게 결합된 단계는 3%(cv)만큼 낮은 반복성 값을 제공합니다. 희석 선형성 측정은 ml당 1x106~1x109입자수(입도 및 굴절률에 따라 다름)의 농도 범위에서 13%만큼 낮은 오차로 정확한 결과를 제공합니다.
NTA 농도 측정 업그레이드는 그림 5와 같이 사용자 설정(카메라 레벨 및 검출 임계값)에 대한 농도 측정의 민감도를 줄여줍니다. 각각 다른 카메라 레벨에서 기록된 샘플을 다양한 검출 임계값에서 분석하였습니다. NTA 농도 측정 업그레이드 적용 전에는 선택한 검출 임계값에 따라 농도 결과가 변했지만 업그레이드 적용 후에는 시험한 검출 임계값 범위에 걸쳐 결과가 서로 유사했습니다. 각각 다른 카메라 레벨에서 기록되었지만 동일한 검출 임계값에서 분석된 결과는 마찬가지로 업그레이드 적용 전에는 변동이 있었지만 이는 업그레이드 적용 시 크게 감소하였습니다.
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업그레이드 적용 전에는 사용자 설정의 결과로 전체 입자 농도가 변하는 것으로 나타났지만(그림 5) 업그레이드 적용 시에는 전체적인 분포의 변동성이 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 6). 이러한 감소는 다양한 범위의 입도, 농도 및 시료에 대해 확인되었습니다.
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세포외 소포체(extracellular vesicles)는 최근 집중적인 연구가 이루어지고 있는 분야입니다. 이 소포체(vesicles)는 광범위한 진핵생물과 원핵생물에 존재하며 다양한 생리적, 병리학적 과정과 관련이 있는 것으로 보입니다. 소포체는 일반적으로 세포의 엔도좀에서 생성되는 엑소좀과 세포막 발아에 의해 생성되는 미세소포로 나뉩니다. 이 세포형 물질의 발생, 구조, 기능 및 특성에 대해서는 여전히 많은 논란이 있습니다. 또한 크기에 대해서도 같은 논란이 있지만 대체로 연구자들 사이에서는 크기가 더 작은(직경 100nm 미만) 것을 엑소좀 소포체로, 더 큰(일반적으로 최대 직경 1µm까지) 것을 미세소포로 분류하는 것으로 합의되어 있습니다.
NTA 농도 측정 업그레이드는 또한 엑소좀 및 미세소포를 포함하는 비표준 샘플에 대한 농도 측정의 정확도 및 정밀도를 개선하는 것으로 나타났습니다(그림 7). 이와 같은 엑소좀을 사용한 예에서는 서로 다른 사용자들이 대표적으로 카메라 레벨 14, 15 또는 16을 선택하였습니다. 업그레이드의 적용은 각각 다른 카메라 레벨에서 측정의 반복성을 높이고 설정으로 인한 차이를 감소시키는 것으로 나타났습니다.
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NTA 농도 측정 업그레이드는 다양한 범위의 샘플 크기, 농도 및 시료에 대해 농도 측정의 정확도 및 정밀도 모두를 개선하는 것으로 나타났습니다. 업그레이드의 적용으로 실험실내 및 실험실간 반복성 및 재현성이 크게 개선되었으며 또한 이를 통해 측정에 대해 사용자가 선택한 캡처 및 분석 설정의 영향도 크게 줄어드는 것으로 나타났습니다. NTA 주사기 펌프의 사용으로 입도 및 농도 측정 모두의 정확도, 정밀도 및 반복성이 크게 증가하였고 또한 업그레이드는 엑소좀 및 미세소포와 같은 비표준 샘플 유형의 농도 측정에도 긍정적인 효과가 있음을 보였습니다.
| 매개 변수 | 사양 |
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| 반복성 | 3%(업그레이드 적용 전에는 15%) |
| 재현성 | 10%(업그레이드 적용 전에는 44%) |
| 희석 선형성 오차 | 13% |
| 농도 범위 | 1x106~1x109입자수/ml |
이 프로젝트는 연구비 지급 합의 No 604347 하에 연구, 기술 개발 및 시연을 위한 유럽 연합의 Seventh Programme으로부터 연구비 지원을 받았습니다.
