키나아제 억제제 메커니즘 발견: ITC가 그 방법을 안내한다.

서론

유기체의 키놈은 게놈에 있는 일련의 단백질 키나아제이고 단백질 변형 효소는 수많은 치료 분야의 잠재적인 대상입니다. 최근 몇년간 사용 가능한 키나아제 결정 구조의 폭발적인 증가와 함께 인간 키놈의 특성을 분석하는 연구에서 약물적 개입을 위한 잠재적 대상으로 키나아제를 점차 집중적으로 다루고 있습니다.

1980년대 말 제약 산업에서 키나아제에 관심을 가짐에 따라 개발된 대부분의 키나아제 억제제는 효소의 ATP 결합 부위를 대상으로 삼고 있습니다. 그러나 대상 BCR-Abl 키나아제의 구조 재배열을 유도하는 약물 Gleevec™(타이로신-키나아제 억제제)은 이 분야의 연구를 활성화하는 역할을 했습니다. 이러한 상황이 ATP 부위 이외의 결합과 키나아제 활성화를 방지하려는 시도를 포함하여 키나아제 억제를 다루려는 혁신적인 아이디어로 이어졌습니다.

효소 반응에 대한 세부 연구는 새로운 아이디어를 바탕으로 화합물 작용에 대한 메커니즘을 분석하는 데 중요한 역할을 합니다. 한 가지 아주 유용한 기법은 등온 적정 열량측정법(ITC)인데, 대상 단백질에 대한 화합물 결합의 전체적인 열역학적 프로파일을 제공합니다. 생성된 데이터를 통해 자유 효소, 효소-기질 복합체, 효소-생성물 복합체, 활성 및 비활성 효소 등 다양한 효소 형태에 대한 화합물 결합의 친화도 측정 결과를 비교할 수 있습니다.

키나아제 신호 캐스캐이드의 억제는 종양과 염증 부분의 질환 치료를 위한 검증된 치료 접근법입니다. 이 응용 노트에서는 생물학적 활성을 부여하는 키나아제에 대한 분자 간 복합체를 식별하고 또 다른 리간드의 존재 여부가 해당 활성에 영향을 미치는지에 대한 정보를 ITC가 제공할 수 있는지 알아보기 위해 ITC의 응용 분야를 집중적으로 다룹니다.

ITC 개요

등온 적정 열량측정법은 단일 실험에서 친화도(K_D), 리간드 결합 부위의 수(n) 및 결합 반응의 엔탈피(∆H) 등 결합 상호 작용의 여러 특성을 측정합니다. 이 기법은 작업 속도가 빠르고 형광 라벨이 필요하지 않으며 촉매 활성(효소 반응 분석에서 연구를 방해)이 없는 단백질과 함께 사용할 수 있습니다.

ITC 실험은 일정한 온도에서 대상 단백질에 대해 시험 화합물을 적정하는 것과 관련되어 있고 ITC 장비는 결합 작용 동안 열 방출량 또는 흡수량을 측정합니다. 이 기법은 단백질 키나아제에 중점을 둔 약물 발견 작업 동안 다양한 방식으로 사용할 수 있습니다.  

설정 대상은 다음과 같습니다.

• 모델 리간드에 대한 정확한 친화도 측면뿐만 아니라 정확한 화학량에 대해 단백질 구성물과 조제물의 특성을 분석하면 촉매 활성 없이도 기능 단백질의 양을 추정할 수 있습니다.

• 분석의 평가

• 생물학적 활성을 부여하는 분자간 복합체를 식별하고 또 다른 리간드의 존재 여부가 이 응용 노트에서 중점을 둔 시험 화합물의 생물학적 활성에 영향을 미치는지에 대한 정보를 ITC가 제공할 수 있는지 알아봅니다.

대상 단백질 품질 관리

기전 연구를 수행하기 전 대상 단백질에 대한 품질 관리 조사를 실시하는 것이 좋습니다. 이 조사는 단백질의 성분, 순도, 농도, 기능 및 안정성을 검증하는 형태여야 합니다.

열량 측정법은 중요한 두 분야에 적용할 수 있습니다. 알려진 리간드의 적정에서 얻은 친화도 및 화학량과 다양한 대상 단백질에 대한 문헌 값을 비교하여 ITC로 대상 단백질의 기능을 검증했습니다. 단백질의 용융 온도(T_m)가 실험 온도보다 상당히 높은지 확인하기 위해 시차 주사 열량측정법(DSC)과 관련된 기술을 사용했습니다. 고립된 키나아제 영역은 부분적으로만 안정적이고 T_m 값은 약 40°C입니다(그림 1). 상세한 기전 연구에 착수하기 전 대상 단백질의 특성을 분석하는 것과 같은 기법을 적용하면 장기적으로 시간과 비용 측면에서 효율적일 수 있고 단백질 품질이 좋지 않아 발생하는 인위적이고 잘못된 결과를 방지할 수 있습니다. 키나아제 영역의 낮은 용융 온도에서는 잠재적으로 낮은 안정성을 나타내고 개선된 정제 프로토콜, 보관 또는 분석 조건이 필요함을 보여 줍니다.

그림 1: 리간드 결합 연구 전 단백질 안정성을 조사하기 위해 DSC 사용 빨간색 선은 DSC 데이터를 나타내는 선임. 파란색 선은 풀림 모델에 가장 적합한 선임

작용 메커니즘의 이해

또 다른 리간드가 있는 경우 시험 화합물의 생물학적 활성에 영향을 미치는지에 대한 정보는 약물 발견에 중요합니다. 두 번째 리간드는 시험 화합물의 활성에 영향을 미치지 않거나 화합물의 결합과 직접 또는 간접적으로 경쟁하거나 시험 화합물이 효과를 발휘하기 위해 실제로 필요할 수 있습니다.

시험 화합물의 작용 메커니즘을 파악하면 IC₅₀ 값 측정에 사용되는 것과 다른 기질 농도에서 세포 활성을 해석하거나 예측하는 데에 유용합니다. 이 정보는 3D 구조의 연관성에 대한 이해를 돕는데, 이러한 문제는 다른 분자 간 복합체에서 해결할 수 있습니다. 작용 메커니즘에 대한 정보를 사용하여 후속 분석을 강구할 수 있고 이 분석은 특정 분자 간 복합체를 대상으로 할 수 있습니다. 키나아제 억제제는 키나아제 단백질에 우선적으로 결합되거나 이 단백질의 비활성 형태를 유도할 수 있습니다. 이 형태에 대해 시험 화합물의 결합 친화도를 비교하면 활성 또는 비활성 형태의 단백질에 대한 화합물 결합을 계속 개발할 것인지를 결정하는 데 유용합니다. 이 유형에 대한 결정은 키나아제 약물 발견과 관련된 후속 공정에 영향을 미칩니다.

메커니즘 해석

치료상 중요한 효소 중에서 키나아제는 단순히 화합물 간섭에 대한 대상 단일 분자는 아닙니다. 촉매 과정 동안 키나아제는 단백질 기질, ATP, 중간 물질 및 제품과 결합합니다(그림 2). 이러한 다른 형태의 효소는 여러 다양한 입체 배열로 존재할 수 있습니다. 또한 화합물을 지향하고 다른 생화학적 분석이 편향될 수 있는 다른 형태의 효소가 존재합니다. ATP의 생리학적 농도는 약 2mM이고 이는 ATP가 ATP 부위에서 화합물 결합과 매우 효과적으로 경쟁할 수 있음을 보여 줍니다. 따라서 ATP(비경쟁적 화합물) 전 또는 후에 결합하거나 ATP(경쟁력이 없는 화합물) 후에만 결합하는 화합물을 찾는 것은 키나아제 약물 발견에 유용합니다. 그러나 기존의 키나아제 억제제는 효소의 ATP 부위를 대상으로 하고 효소 결합을 위해 ATP와 경쟁하는 것으로 예상됩니다. 다른 화합물은 알로스테릭 부위를 대상으로 할 수 있으며 ATP와 경쟁하지 않을 것으로 예상됩니다. 화합물의 작용 메커니즘을 분석하면 ATP 또는 단백질 기질이 있는 경우 시험 화합물의 친화도가 증가하고 감소하거나 이 친화도에 영향을 미치지 않는지를 확인할 수 있습니다. 이 특성에 대한 연구는 분자 수준에서 구조 활성 관계(SAR)를 파악하는 데 유용하고 새로운 약물 분자 구조를 찾는 경우 중요합니다.

그림 2: 단백질 키나아제의 추정 촉매 과정 이 간소화된 도표에서 효소는 촉매 과정 동안 기질 및 제품과 결합되고 인산 전달 작용 동안 최소한 네 가지 효소 형태가 배치됩니다. 다른 효소 형태 각각은 동적일 수 있고 다양한 입체배열에 접근할 수 있으며 각 키나아제 효소는 화합물 간섭에 대한 몇 가지 다른 대상을 보여 줄 수 있습니다. ITC를 사용하면 최소한 몇 가지 고립된 효소 형태에서 결합 친화도를 측정할 수 있고 억제제의 구조 활성 관계(SAR)를 쉽게 파악할 수 있습니다.

효소 반응 분석에서는 반응 경로를 따라 발생하는 특정 효소 형태를 배치하도록 구성하지 않습니다. 그 결과, 최대 친화도와 관련된 효소 형태 정보를 바로 얻기가 어렵습니다. ITC는 미리 결정된 효소 형태에 대한 결합 친화도를 측정하여 이러한 제한점을 극복할 수 있습니다. 자유 효소에 대한 결합이 가장 간단한 접근법이지만, 촉매 작용의 메커니즘에 따라 효소-단백질 기질, 효소-ATP, 효소-ADP 또는 효소-인 제품 복합체 등의 다른 효소 형태를 조사하기 위해 ITC 조건을 갖출 수 있습니다. 가수 분해할 수 없는 ATP 유사체를 사용하면 두 기질로 효소의 삼중 복합체에 대한 잠재적인 화합물 결합을 조사할 경우에 유용합니다.

시험 화합물의 결합에 미치는 ATP의 영향을 분석하는 실험을 대상 단백질 키나아제에 대해 실시했습니다. 100µM ATP가 있거나 없는 경우 시험 화합물에 대해 Malvern MicroCal™ VP-ITC를 사용하여 ITC 적정을 실시했으며 그 결과 ATP에 대해 약 60 × K_D가 도출되었습니다(그림 3).

그림 3: 비경쟁적 억제제 결합 100µM ATP가 있거나(파란색) 없는 경우(빨간색)의 대상 단백질 키나아제에 대한 시험 화합물의 적정 ATP가 있는 경우 매개 변수 값은 K_D = 0.19µM, ∆H = -17.4kcal/mol, n = 0.9이고 ATP가 없는 경 매개 변수 값은 K_D = 0.17µM, ∆H = -9.4kcal/mol, n = 1.1입니다.

ITC 결과는 ATP가 셀에 단백질과 함께 포함된 경우 키나아제에 대한 화합물 결합의 친화도 변화가 없음을 명확하게 보여 줍니다. 엔탈피 값은 친화도에는 영향을 미치지 않지만 결합에 대한 엔탈피에는 상당한 영향을 미칩니다. 이 결과를 통해 화합물은 ATP 결합과 관련하여 비경쟁적이고 ATP가 존재하는 경우에는 결합 모드의 변화가 있을 수 있음을 알 수 있습니다. 즉, ITC는 화합물 결합의 기전 세부 사항을 분석하는 데 유용하고 이 기법의 이원적 프로브 특성은 친화도와 결합 엔탈피를 측정하는 데에도 도움이 됩니다. 유사한 실험에서 ATP와 관련하여 경쟁력이 없는 반응이 동일한 단백질 키나아제에 대한 다른 시험 화합물 결합에서 관찰되었습니다. ATP가 없는 경우 K_D는 > 50µM(표준 ITC 실행 시 측정할 수 없음)인 반면 ATP가 있는 경우 0.7µM으로 측정되었습니다. (그림 4).

그림 4: 경쟁력이 없는 억제제 결합 적정. ATP 및 단백질 키나아제 복합체에 대한 시험 화합물 결합의 적정 매개 변수 값은 K_D = 0.56µM, .H = -2.3kcal/mol, n = 1.4였습니다. ATP가 없는 경우 어떤 결합도 관찰되지 않았습니다.

개별 단백질 복합체에 대한 결합을 바로 모니터할 수 있는 경우의 이점을 또 다른 예(화합물의 높은 친화도 결합이 신호 경로에서 두 개의 연속적인 키나아제에 대한 복합체를 생성한 것으로 보이는 사례)에서 확인했습니다. ITC를 사용하면 복합체가 실제로 형성되었음을 입증한 후 상위 키나아제와 상위 및 하위 키나아제의 복합체에 대해 화합물의 결합을 연구할 수 있습니다. 복합체에 대한 화합물 결합에서 친화도가 5배 증가한 것으로 입증되었습니다(그림 5).

그림 5: 상위 키나아제(빨간색) 및 이 키나아제의 복합체에 대한 화합물 결합과 하위 기질 키나아제(파란색)의 비교 복합체에 대한 결합에서 친화도가 5배 증가한 것을 보여 줍니다.

개요

열량 측정법은 단백질 키나아제 억제 연구에서 유용한 것으로 입증되었습니다. 이 기법은 대상 단백질에 대한 품질 관리 점검을 용이하게 하고 해리에 기여하며 억제제 결합 메커니즘을 파악합니다.

Malvern MicroCal Auto-iTC200 및 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 시스템 등의 고처리량을 갖춘 자동화된 장비가 등장함으로써 해당 분야에 부가 가치를 제공합니다. 시약을 적게 소모하려는 경향에 따라 합리적인 약물 설계 공정에서 열량 측정법이 계속 사용되고 있습니다.

작성자 감사의 글

Geoff Holdgate(연구 책임자, Global Compound Sciences, Leadgeneration- Discovery Capabilities & Sciences, Astra Zeneca Pharmaceuticals, Mereside, Alderley Park, Macclesfield, SK10 4TG, UK)