DSC 데이터는 용액 속 단백질의 안전성을 예측하는 데 유용합니다. Tm은 열 안정성을 나타내고, 다른 제형의 Tm 측정에서는 낮은 온도의 응집과 다른 비가역성 변화에 대한 민감도를 대략적으로 측정합니다.
치료제로 사용하기 위한 생체 분자는 환자에게 투여된 다음, 작용 부위로 전달된 직후 활성, 네이티브 형태로 안정화되어야 합니다. 조기 단계의 바이오 의약 제형에 대한 안정성 검사는 향후 약물 개발과 관련하여 최상의 잠재력을 보여 주는 것에 투자가 집중되도록 해 줍니다. 시차 주사 열량측정법(DSC)은 단백질 제형 안정성을 위한 최적의 용액 조건을 신속하게 측정하는 데에 사용할 수 있는 기법으로, 제형 후보 물질을 식별하고 개발을 가속화할 수 있습니다. 이 응용 노트에서는 Malvern MicroCal DSC 기술과 제형 개발 시 이 기술을 사용하는 방법을 설명합니다.
바이오 의약 개발에서 조기에 수행해야 할 사항은 바이오 의약품을 액체 또는 동결 건조된 분말로 제공할 것인지를 선택하는 것입니다. 일반적으로, 액체 제형은 제조 시 비용이 적게 들고 사용하기에 간편하지만 냉장 상태로 보관해야 하고 덜 안정적입니다. 동결 건조된 단백질은 제조 시 비용이 많이 들고 환자에게 투여하기 전 용해해야 하지만 상온에서 보관할 수 있고 향상된 안정성을 제공할 수 있습니다. 또한 최종 사용자의 편의성도 고려해야 할 요소입니다(1,2). 제형 연구자는 단백질이 충분한 기간 동안 용액에서 안정성을 유지할 수 있는지 또는 동결 건조된 형태로 안정적으로 유지될 수 있는지를 확인해야 합니다.
수용액의 단백질은 네이티브(접힌) 형태 및 변성된(풀린) 형태 간에 균형을 이루고 있습니다. 소수성 상호 작용 및 수소 결합은 주요 안정화 요소이고 단백질이 풀리고 변성되는 문제를 극복할 수 있어야 합니다. 구조적 엔트로피는 안정화시키는 힘을 약화시키고 생체 고분자가 풀리게 합니다(3). 변성된 화합물질(황산도데실나트륨 및 구아니딘염산)이 용액에 추가되거나 가열되면 단백질이 풀리게 됩니다. 변성된 단백질은 단백질 가수 분해(8), 산화(9) 및 탈아미드화(10)와 같은 비가역성 화학 공정에 더 민감한 경향이 있고(4-7) 이 경우 불안정화될 수 있습니다. 변성된 단백질은 응집될 가능성이 있고 응집으로 인해 단백질이 파괴되고 안정성을 상실할 수 있습니다(11-14).
제형 개발 전에 단백질의 특성을 분석해야 합니다. 이에는 분자량, 아미노산 조성, 3차원 구조, 이황화 결합의 존재, 글리코실화, 공동 인자의 요건, 억제제, 용해도, 열역학적 매개 변수, 기능, 등전점, 소수성 및 표면적의 측정이 포함될 수 있습니다. 이러한 모든 정보는 단백질에 대한 최적의 제형을 설계하는 데 유용합니다. 합리적인 약물 설계 접근법을 사용하여 선택한 용액의 최대 안정성과 최고 효율성을 위해 생체공학적 단백질을 구성할 수 있습니다.
단백질의 액체 제형은 환자의 대상 부위에 최종적으로 전달될 때까지 생산, 포장, 보관 및 배송하는 동안 생체 고분자의 대생물 작용과 안정성을 유지하는 데에 유리해야 합니다. 제형 개발 동안 고려해야 할 매개 변수는 단백질 농도, 첨가제(부형제)의 존재, pH, 보관 온도, 용기, 빛에 대한 노출, 공기 및 습도 등입니다.
제형 개발의 다른 요소는 약물 전달 메커니즘과 관련되어 있습니다. 예를 들어 정맥으로 전달되는 바이오 의약품은 희석할 수 있어야 하고 단백질이 잘 녹지 않는 경우 환자의 혈류에서 침전될 수 있습니다. 또한 약물을 주입하는 경우 제형의 조성이 환자의 조직을 손상하거나 통증을 유발해서는 안됩니다. 추가 고려 사항은 용기 또는 장치 표면(주사기, 펌프 등)으로 단백질이 잠재적으로 흡착되는지에 대한 것입니다.
단백질의 안정성은 가속화 연구 및 실시간 안정성 연구를 포함하여 다양한 분석 방법을 사용하여 측정합니다. 응집/침전, 산화, 단백질 가수분해 저하 및/또는 이황화물 결합 셔플링에 대한 정도를 평가합니다. 약물이 대생물 작용의 손실없이 전달될 수 있도록 배송 상태를 시험합니다.
시차 주사 열량측정법(DSC)은 미세 열량측정법이고 네이티브 형태로 생체 분자의 안정성을 분석하는 데 사용됩니다. 일정한 속도로 가열된 경우 분자의 열변성과 관련된 열변화를 측정하여 이러한 분석을 수행합니다. 열 전이 중간점(Tm)을 측정하면 안정성을 빠르고 간편하게 파악할 수 있습니다. Tm이 높을수록 생체 분자가 더 안정적입니다.
DSC 장비에는 생체 분자와 완충액, 완충액으로 채워진 기준 셀이 포함된 샘플 셀이 있습니다. 일정한 속도로 셀의 온도를 높이기 위해 전원이 가열기에 공급됩니다. 온도가 증가하는 동안 장비는 샘플과 기준 셀 간의 온도 차를 모니터합니다. 두 셀에서 동일한 온도를 유지하는 데 필요한 셀 사이의 열 흡수량 차이는 겉보기 초과 열 용량을 결정하게 됩니다(그림 1). 단백질이 네이티브에서 변성 형태로 전환되는 경우 엔탈피 변화에 대한 전이 온도의 중간점(Tm)이 발생합니다. 이 Tm에서 단백질의 50%는 네이티브 상태이고 나머지 50%는 변성된 상태이므로 두 가지 상태 전이를 가정합니다(그림 1). 다른 영역의 활성 또는 하나 이상의 구조 영역이 있는 일부 단백질은 하나 이상의 Tm 값을 갖습니다. 연구자는 제형 변화로 인해 최대 효과를 나타내는 1개 또는 2개의 Tm 값에 초점을 맞출 수 있습니다.
Tm은 열 안정성 지표이고 일반적으로 Tm 값이 높을수록 단백질이 더 안정적입니다. Tm 값이 높으면 단백질은 낮은 온도에서 풀림과 변성의 영향을 훨씬 적게 받습니다. 다양한 조건과 첨가제를 알아본 다음 DSC는 안정성을 위해 최적의 제형에 상응하는 최고 Tm 값을 가진 제형을 결정할 수 있습니다(4,5,7,15,16).
화학 공정 동안 열이 방출되거나(발열) 흡수됩니다(흡열). 네이티브에서 변성된 단백질까지의 전이는 흡열 반응입니다. 구조적 전이 동안의 엔탈피(∆H) 변화는 전이가 이루어지는 영역을 통합하여 측정합니다(그림 1). 변성된 단백질의 열 용량(Cp)은 네이티브 단백질의 열 용량보다 더 높으므로 그 결과, 열 변성에 대한 양성 ∆Cp가 도출됩니다(그림 1).
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Malvern MicroCal™ VP-Capillary DSC(그림 2) 및 Malvern MicroCal VP-DSC 시스템은 용액의 생체 고분자 연구에 사용됩니다. Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 시스템은 높은 샘플 처리율(24시간 내에 최대 50개 샘플)과 빠른 주사 속도(최대 250°C/h)로 여러 제형에 대한 Tm 검사를 처리하도록 특별히 설계되었습니다. 완전히 통합된 오토샘플러는 무인 작동이 가능합니다. Malvern MicroCal VP-Capillary DSC와 Malvern MicroCal VP-DSC 시스템의 기능 비교는 표 1을 참조하십시오.
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| MicroCal VP-DSC | MicroCal VP-Capillary DSC | |
|---|---|---|
| 활성 셀 용량 | 500μl | 130μl |
| 필요한 일반적인 최소 단백질 농도 | 0.02 ~ 0.1mg/ml | 0.2 ~ 0.5mg/ml(Tm)> 1.5mg/ml(ΔCp 및 ΔH) |
| 최대 스캔 속도 | 90°C/h | 250°C/h |
| 온도 범위 | -10°C ~ 130°C | -10°C ~ 130°C |
| 스캔당 일반적인 시간 | 60 - 150분 | 35 ~ 55분(주사 속도 및 온도에 따라 달라짐) |
| 하루 최대 스캔 | 4 - 6(수동)(8시간) | ~ 50(무인)(24시간) |
| 자동화된 셀 충진 및 세척 | 아니요 | 예 |
| 96 웰 플레이트당 샘플 | 사용할 수 없음 | 48 |
제형 개발의 주요 문제는 어떤 용액 조건에서 네이티브 단백질이 최대로 안정화되는지를 발견하는 것입니다. 가장 높은 Tm을 유발하는 조건에서는 낮은 온도에서 최장 시간 동안 단백질이 네이티브 상태로 유지됩니다. DSC를 사용하여 다른 pH와 완충액 조건을 먼저 검사한 다음 부형제와 방부제를 검사합니다.
그림 3에서 단백질 CD40L의 Tm은 pH에 대해 플롯했습니다. 37°C에서 7일간 배양한 후 CD40L의 응집을 측정했습니다. 응집이 최소화된 경우 Tm 최적화는 pH 조건과 상관관계를 갖습니다(16). pH, Tm 및 응집 간의 상관관계는 대식 세포 증식 자극 인자로 확인했습니다(4).
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DSC로 단백질의 Tm 변화를 측정하는 것은 비교적 간단한 공정입니다. 그림 4는 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC로 측정한 것과 같이 키모트립시노겐의 Tm 변화를 보여 줍니다. Tm은 pH가 증가함에 따라 증가되었고 높은 pH에서 네이티브 형태의 키모트립시노겐이 높은 안정성을 나타냈습니다.
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부형제는 단백질의 안정성을 향상시키는 첨가제로, 설탕, 아미노산, 산화 방지제, 중합체, 알코올, 글리세롤 및 계면 활성제 등이 포함됩니다.
최적의 pH 및 완충액이 결정되면 다른 부형제를 단백질 용액에 추가합니다. 부형제가 Tm을 증가시키는 경우 네이티브 형태의 단백질은 부형제를 사용함에 따라 부형제를 사용하지 않을 때보다 더 안정화됩니다.
인터루킨-1 수용체, IL-1R의 액체 제형을 개발하는 동안 부형제 검사를 실시했습니다(5). IL-1R에 대한 두 가지 주요 전이가 발생했습니다(하나는 Tm이 48°C에 근접하고 다른 하나는 66°C에 근접함). 부형제를 검사하기 위해 낮은 온도 전이의 Tm 값을 선택했습니다. 이 전략은 낮은 온도 전이의 Tm을 상승시키는 부형제를 찾으려는 것인데, 네이티브 단백질의 안정성이 분명하게 변화된 것으로 나타났습니다. 23개 부형제를 검사했습니다(표 2).
| 부형제 | 완충액의 농도(g/ml) | 몰비[Ms/Mp]* | Tm(°C) |
|---|---|---|---|
| 대조† | 0.00 | – | 48.1 |
| 아스코르브산 | 0.05 | 2037 | 36.7 |
당류 | |||
| 마니톨 | 0.0517 | 2037 | 46.7 |
| 락토오스 | 0.0972 | 2137 | 49.7 |
| 수크로오스 | 0.0972 | 2037 | 49.7 |
| 포도당 | 0.0512 | 2037 | 49.6 |
폴리머 | |||
| PVP(MW 10000) | 0.01 | 7 | 48.9 |
| PEG(MW 300) | 0.0003 | 7 | 49.4 |
| PEG(MW 1000) | 0.001 | 7 | 49.1 |
| PEG(MW 3350) | 0.00335 | 7 | 48.7 |
| 덱스트란 40 | 0.0392 | 7 | 48.0 |
폴리올 | |||
| 글리세롤 | 0.01 | 779 | 48.7 |
| Ethanol | 0.0051 | 779 | 48.6 |
| Ethanol | 0.05 | 7617 | 43.8 |
염류 | |||
| NaCl | 0.00584 | 717 | 53.1 |
| CaCl2 | 0.0111 | 717 | 41.1 |
아미노산 | |||
| 글리신 | 0.01 | 955 | 46.2 |
| L-라이신 | 0.01947 | 955 | 48.3 |
| L-시스테인 | 0.01614 | 955 | 51.3 |
| L-알라닌 | 0.01187 | 955 | 46.2 |
| L-아르기닌 | 0.0232 | 955 | 49.1 |
계면활성제 | |||
| Pluronic™ F68 | 0.0001 | 4 | 46.6 |
| Tween™ 80 | 0.001 | 5 | 45.8 |
조합물 | |||
| 포도당/염화나트륨 | 0.0512 – 0.00584 | 2037/717 | 52.2 |
*Ms = 부형제의 몰/Mp = 단백질의 몰 †대조 완충액은 20mM의 구연산염 완충액임(pH 6.0). 이 완충액에 추가된 부형제. 표 출처: Remmele, R.L. et al. (5). | |||
염류를 추가하여 Tm을 증가시킬 수 있는지를 확인하기 위해 완충액의 이온 강도를 조절합니다. IL-1R에 대해 100mM의 NaCl을 추가하면 최대로 안정화되었고 보통의 이온 강도에서 Tm이 48°C에서 53°C로 변경되었습니다. 이 안정화 효과를 통해 단백질의 염 이온과 하전 그룹 간에 직접적인 상호 작용이 이루어졌음을 알 수 있습니다(5). NaCl의 농도가 1500mM으로, 하전된 부위를 포화시키기 위해 필요한 농도보다 높은 경우에도 염 이온이 증가하면 IL-1R의 Tm이 계속 증가합니다(그림 5). 이 데이터를 통해 염 이온이 물 구조에 영향을 미치고 이로 인해 단백질 구조가 안정화됨을 알 수 있습니다. 두 전하 간 상호 작용과 물 구조의 변화는 네이티브 IL-1R 구조에 안정성을 가져다 줍니다.
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약물을 여러 번 투여하는 형태로 제공하는 경우 미생물 성장을 방지하기 위해 방부제가 추가됩니다. 그러나 이 방부제는 단백질에 영향을 미쳐 불안정해지도록 할 수 있습니다. IL-1R의 Tm에 대한 방부제의 영향을 검사했습니다(5). 방부제인 메타 크레졸, 페놀, 및 벤질 알코올은 낮은 온도에 대한 온도 전이의 변화에 따라 IL-1R을 불안정하게 만들었습니다(표 3). DSC 데이터를 통해 세 방부제(가장 높은 Tm에서 생성된 페놀, 그 다음은 메타 크레졸, 벤질 알코올 순으로 측정)에서 IL-1R의 안정성 순서를 측정했습니다. DSC 안정성 데이터는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정한 것과 같이 IL-1R의 응집과 상관되어 있습니다. 7일 및 60일 후 Tm이 높을수록 응집이 적게 관찰되었습니다.
| DSC | SEC | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 7일 | 60일 | ||||||
| Tm1(°C) | Tm2(°C) | Tm3(°C) | Agg % | Native % | Agg % | Native % | |
| 대조 용액 | 50.8 | 53.7 | 66.3 | 0.66 | 98.93 | 1.50 | 97.54 |
| 0.065% 페놀 | 50.3 | 53.4 | 66.5 | 1.02 | 98.62 | 3.07 | 96.02 |
| 0.1% m-크레졸 | 48.4 | 51. | 65.8 | 1.37 | 98.25 | 5.1 | 93.92 |
| 0.9% 벤질 알코올 | 45.2 | 48.5 | 63.6 | 2.93 | 96.92 | 16.46 | 83.09 |
| 대조 용액: 20mM 구연산 나트륨 완충액(pH 6.0, 100mM NaCl) 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 대해, IL-1R 용액은 크로마토그래피 적용 전 표시된 시간 동안 37°C로 보관함. Agg % = % 응집, SEC 적용 후 고분자량 단백질 피크를 통합하여 측정함. 네이티브 % = % 네이티브 IL-1R, SEC 적용 후 주요 단백질 피크를 통합하여 측정함. 출처: (5) | |||||||
Tm 검사에 따라 가속 안정성 연구를 통해 최고 제형 후보 물질을 평가합니다. 단백질은 다른 제형에서 전처리한 다음, 37°C로 보관합니다. 응집의 양은 가속 안정성 연구 동안 간격을 두고 크기 배제 크로마토그래피로 측정하고 단백질은 단백질 가수 분해를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 사용하여 분석합니다.
마지막으로, 최고의 제형 후보 물질은 실시간 안정성 연구를 실시하여 단백질의 보관 수명을 측정해야 합니다. 단백질이 활성 상태를 유지하도록 연구하는 동안 생물학적 분석법과 분석 시험을 실시합니다.
DSC는 다년간 제형 개발 동안 단백질 안정성을 평가하는 검사 도구로 사용되었고 자동화된 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC를 사용하면 Malvern MicroCal VP-DSC에 비해 처리량이 증가하여 신속하게 검사를 수행할 수 있습니다(표 1). 다른 pH와 부형제에서 단백질의 Tm을 측정하기 위해 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC를 사용했으며, Tm의 변화는 SEC 데이터와 상관되어 있고 안정성 검사 도구로 DSC를 사용했음을 보여 줍니다(17).
DSC 데이터는 용액 속 단백질의 안전성을 예측하는 데 유용합니다. Tm은 열 안정성을 나타내고, 다른 제형의 Tm 측정에서는 낮은 온도의 응집과 다른 비가역성 변화에 대한 민감도를 대략적으로 측정합니다. 안정성, 보관 수명 및 배송에 대한 향후 연구를 위해 열 안정성이 가장 우수한 제형을 선택합니다. DSC를 사용하면 제형 개발 시 시간과 비용을 절약할 수 있고 전자동 시스템을 통해 약물 개발의 중요한 영역에서 효율성과 생산성을 개선할 수 있습니다.
BioPharm Guide to Formulation, Fill and Finish, 2001, supplement to BioPharm (Advanstar Communications)(제제, 충진 및 완성에 대한 생물 약제 안내서, 2001, BioPharm 증보판(Advanstar Communications)).
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