DSC 데이터를 사용하여 단백질의 개발 공정 동안 항체 획득 단계에 대한 가장 안정화된 용리 조건을 식별하고, 이를 통해 비용 절감을 달성했습니다.
바이오 의약 공정 개발은 비용과 시간이 많이 들 수 있습니다. 궁극적인 목표는 비용 효율적이고 재현성 높고 강력한 경로를 통해 정제된 제품의 생산량을 극대화하는 것입니다. 배치 부적합 상태는 중요한 경제적인 문제를 야기할 수 있으므로 임상 개발을 통한 연구에서 상업적 제조에 이르기까지 전체 개발 경로에서 단백질 안정성을 철저하게 파악하는 것이 바이오 의약품 상업화에 중요합니다.
단백질 바이오 의약품을 투여할 때까지 안정성을 유지하고 활성 구조를 보존하는 것은 필수적인 사항입니다. 이러한 목표는 바이오치료제의 물리적 성질을 파악하도록 설계된 연구를 통해 부분적으로 달성할 수 있습니다. 대개 단백질은 복잡성과 정교한 구조로 인해 고유한 안정성 문제를 갖고 있습니다. 생물학적 활성에 직접적인 영향을 미치는 단백질의 구조적 무결성에 대한 다양한 환경 요소(예: pH, 온도 및 이온 강도)의 효과를 측정하기 위한 안정성 연구는 공정 개발 시 반드시 필요합니다. 이 스트레스 연구는 분자의 취약점을 드러내어 중요한 기능 식별을 돕고, 적절한 완충액, pH, 이온 강도 및 부형제 선택을 통해 효과적인 대응책을 개발하고 변성 메커니즘을 식별할 경우 합리적인 접근법을 제공합니다.
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정제 방법을 개발하면서 안정성 연구를 수행하면 연구자는 더 효과적인 방법을 설계할 수 있습니다. 정제 공정을 개발하는 동안 안정성 연구를 통해 다음을 수행할 수 있습니다.
안정성 연구는 강력한 안정성 지시 분석법을 개발하도록 지원합니다. 일반적인 포뮬레이션 개발 연구 동안 고려해야 할 조건의 범위를 최소화하여 이러한 데이터를 통해 약품의 포뮬레이션 개발을 가속화할 수 있습니다. 이 경우 자원, 비용 및 시간이 절약됩니다.
이 응용 노트에서는 항체 정제 공정의 개발을 안내하기 위해 시차 주사 열량측정법(DSC)의 유용성을 집중적으로 다룹니다. 특히 이 노트에서는 조기 임상 의약품 제조 시 비용을 절감하고 단백질 A 획득 단계 개발 중 최적의 용리 조건을 파악하기 위해 DSC 데이터를 사용하는 방법을 설명합니다.
DSC는 공정 및 처리 작업 내내 단백질 안정성을 모니터하는 방법을 제공합니다. 이렇게 하면 공정 또는 분석 개발 동안 이례적인 상태 또는 단백질 거동이 발생할 때 분자를 보호할 수 있는 향상된 조건을 마련할 수 있습니다.
모든 단백질은 PD-10 탈염 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 투석 또는 완충액 교환으로 표시된 완충액에서 전처리했습니다. 최종 단백질 농도는 약 1mg/ml였습니다. 분당 1°C의 주사 속도와 5°C ~ 90°C의 온도 범위를 사용하여 Malvern MicroCal VP-DSC 시스템으로 단백질을 분석했습니다. 서모그램 분석은 두 가지 상태 모델 또는 두 가지 상태가 아닌 모델(non-two-state model)을 사용하여 Origin™ 소프트웨어로 수행했습니다.
단백질 A 친화도 크로마토그래피는 단일클론 항체 정제에 대한 초기 획득 단계로 사용됩니다. 단백질 A는 많은 면역글로불린(Ig) 항체 분자의 Fc 영역에 결합됩니다. 이 결합 특이성 및 선택성은 단일 단계에서 거의 순수 제품을 생성할 수 있습니다. 항체 분자는 세포 배양에 의해 생성되고 숙주 세포 단백질, 핵산 및 세포 배양 성분으로부터 정제해야 합니다. 무세포 조건의 세포 배양 배지는 단백질 A 친화도 크로마토그래피 매질에 적용됩니다. 항체는 중성 pH(약 pH 7)에서 고정화된 단백질 A에 결합되고 낮은 pH 완충액(예: pH 3.5인 구연산염 완충액)으로 용리됩니다. 용리된 항체는 1M 트리스 pH 9와 같은 완충 용량이 큰 용액을 사용하거나 탈염을 통해 중화합니다
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단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용할 때의 한 가지 문제점은 다른 단백질뿐만 아니라 항체가 용리에 필요한 낮은 pH에서 불안정해질 수 있다는 것입니다. 낮은 pH에서 단백질이 불안정한 경우 용리 중 또는 용리 후에 침전될 수 있습니다.
침전은 대개 단백질 농도에 따라 달라지는데, 농도가 높으면 응집과 침전이 쉽게 일어납니다. 또한 대부분의 크로마토그래피 매질은 매질의 리터당 최소 20g의 항체를 결합할 수 있으나 용리 후 낮은 pH에서 단백질 안정성은 매질 로딩을 제한하는 요소가 됩니다. 많은 항체가 pH에 민감하지만 변성
과 응집에 대한 메커니즘은 구조에 따라 달라지고 최적의 안정성을 위해 다른 완충액이 필요합니다.
단백질 A 크로마토그래피 공정의 경제적인 이점과 로딩 용량을 개선하려면 단백질은 용리 완충액에서 안정화되어야 합니다. DSC를 사용하여 항체의 안정성을 pH 기능으로 분석하고 어떤 첨가제가 낮은 pH에서 단백질 안정성을 향상시킬 수 있는지를 측정할 수 있습니다. DSC에서 증가한 전이 온도(Tm)를 통해 단백질 안정성이 증가했음을 알 수 있습니다. 낮은 pH 용리 완충액에서 항체를 안정화하고 로딩 용량을 증가시켜 단백질 A 크로마토그래피 단계를 효율적으로 활용할 수 있습니다.
사례 연구에서 고객은 항체(항체 X)의 정제 공정을 개선하려고 했습니다. 공정 정보에 의하면 높은 로딩 용량으로 용리되는 동안 항체의 침전으로 인해 초기 결합 용량이 단백질 A 매질의 리터당 2g의 항체 X로 제한되었음을 알 수 있습니다. 항체 X의 안정성에 대한 pH의 영향을 파악하기 위해 트리스를 사용하여 pH 7.0으로 조절한 구연산염 완충액, pH 7.3인 인산염 완충액, pH 3.5인 구연산염 완충액 및 pH 5.0인 구연산염 완충액 등 네 가지 다른 완충액에서 단백질을 전처리했습니다. DSC 데이터(표 1)에서 pH 7.0 및 7.3인 항체 X는 pH 3.5인 항체보다 높은 Tm을 보여 주고 단백질이 높은 pH에서 더 안정적인 것으로 나타났습니다. 풀림 시점 온도는 pH 3.5에 비해 pH 7.0 및 7.3에서 더 높았습니다. pH 5.0의 항체 X는 Tm이 pH 7.0과 유사하고 풀림 시점 온도는 더 낮았으며 pH는 이 항체의 풀림을 측정하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 보였습니다.
| 주요 전이의Tm | 풀림(°C)의 시점 | |
|---|---|---|
| 구연산염-트리스 완충액, pH 7.0 | 68.7 | 60.1 |
| PBS, pH 7.3 | 69.5 | 58.5 |
| 구연산염, pH 5.0 | 71.5 | 48.2 |
| 구연산, pH 3.5 | 59.3 | 34.1 |
| 구연산 + 마니톨, pH 3.5 | 64.7 | 41.0 |
낮은 pH에서 다른 첨가제가 항체를 안정화시킬 수 있는지 측정하기 위해 이 첨가제를 사용하여 낮은 pH 완충액에서 항체 X를 전처리했습니다. 어떤 조건이 항체의 Tm을 증가시키는지 알아보기 위해 DSC 실험을 실시했습니다(그림 2).
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항체 X에 대해 pH 3.5의 구연산염 및 마니톨은 최대 Tm 변이를 유발하고 가장 유리한 안정성을 나타냈습니다. 마니톨을 추가한 경우 pH 3.5의 구연산에 비해 Tm 및 풀림 시점 온도가 증가했습니다. (그림 3)
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DSC 결과는 단백질 A 친화도 매질에 대한 용리 완충액에 마니톨을 추가하면 항체 X의 안정성이 개선됨을 보여 주었습니다. 용리 중 항체 안정성이 향상되면 단백질 A 크로마토그래피 매질에 대한 항체의 로딩 용량이 증가할 수 있습니다.
DSC에서 측정한 단백질 안정성 정보를 사용하여 공정을 개발한 결과, 단백질 A 획득 단계 동안 항체 X의 로딩 용량이 증가했습니다. 구연산염 및 마니톨을 단백질 A 용리 완충액으로 사용하면 구연산염 완충액에서는 항체 X가 리터 당 2g이고 단백질 A 매질에 대해서는 리터 당 15g 이상으로 나타나 용량이 최소 7.5배 증가했습니다.
단백질 A 획득 단계 후 항체 X는 조기 공정에서 보다 농도가 높아졌고 한외여과/디아필트레이션 단계를 제거하고 재료와 공정 시간을 절약하는 결과를 보였습니다.
이 응용 노트에서는 단백질의 개발 공정 동안 항체 획득 단계에 대한 가장 안정화된 용리 조건을 식별하기 위해 DSC 데이터를 사용했습니다. DSC는 크로마토그래피 분석 개발을 수행하기 전 단백질 안정화 완충액 조건을 선택하는 데 유용한 정보를 제공합니다. 정제 공정 개발 시 주요 단계에서 성능을 개선하면 비용이 상당히 절감될 수 있습니다.
이 응용 노트는 Prathima Acharya(이전 Diosynth Biotechnology)에서 작성했습니다. 이 작업에 기여한 정제 개발 그룹의 Rochelle Bazemore, Sorina Morar, Sue Cook 및 Jessica Weaver에게 감사드립니다.
