향상된 바이오치료법을 개발하기 위해 DSC를 사용하여 항체 Fab 영역 안정성 연구

서론

안정성은 치료 항체와 유전적으로 적합한 항체 분절의 개발에 중요한 문제입니다. 낮은 안정성은 다양한 셀 유형에서 항체 발현 수준에 영향을 미칠 수 있고 비기능적이거나 잘못 접힌 물질에 대한 분획 개체군을 유발하거나 면역원성 단백질 응집물이 형성되도록 합니다.

항체 및 항체 유사 단백질은 다수의 분자 본체를 대표하고 사실상 모든 질환 적응증에 인간 임상 시험을 실시합니다. 항체는 중연세 및 경쇄로 구성된 헤테로테트라머입니다. 불변 영역(C_H 및 C_L 사슬)에는 항체 아이소타입 및 서브클래스에 따라 달라지는 불변 아미노산 서열이 포함되어 있습니다. 반면에, 항체 가변 영역은 상당히 다양하고, 높은 특이성과 친화성을 지닌 이질적인 항원을 인식하도록 해 줍니다. 가변 영역 다양성은 V_H(variable heavy) 및 V_L(variable light, 카파 또는 람다) 사슬, 가변 및 불변 영역 간의 수많은 링커 서열, 체세포 과돌연변이의 페어링을 통해 유도됩니다. 가변 영역 내의 다양성으로 인해 한 항체에서 다른 항체로 안정성 변화가 일어날 수 있습니다.

최근까지, 항체가 복잡한 여러 영역 단백질이라는 사실로 인해 전장 항체에 대한 안정성 데이터가 상대적으로 부족했습니다. 이 응용 노트에서는 시차 주사 열량측정법 DSC를 사용하여 17개의 인간 또는 인간화 IgG₁ 및 IgG₄ 항체의 영역 의존 풀림 특성을 조사했습니다(1). 이 조사에는 Tysabri™(다발성 경화증 치료용으로 임상 승인을 받음), I상 또는 II상 시험의 7개 분자, 2007년 FDA에 제출한 시험용 신약(IND) 추적에 대한 4개 분자 및 연구 중인 6개 분자가 포함되었습니다. 데이터세트를 참조 안내서로 사용할 수 있으며, 이 데이터는 항체 발견 분야의 연구자가 열 안정성이 주어진 항체 분자에 대한 문제가 될 수 있는지를 파악하도록 돕습니다.

이 응용 노트의 두 번째 부분에서는 특히 불안정한 항체에 대한 안정성 설계 공정을 설명합니다. 안정화 돌연변이의 조합으로 인해 열 풀림(T_m) 중간점이 92°C(DSC로 측정)인 Fab가 생성되었습니다. 안정화는 대장균에서 항체 분절에 대한 상당히 향상된 기능 발현을 유발했습니다(2).

재료 및 방법

이 연구에 사용된 재료 및 방법은 앞에서 설명했습니다(1,2). DSC 작업은 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 시스템을 사용하여 수행했습니다.

그림 1. (A) BIIB7 IgG₁에 대한 DSC 곡선 위 곡선은 전장 인간 IgG₁ 항체 구조를 나타낸 것입니다(13). (B) 4개의 인간 IgG 서브클래스를 나타낸 DSC 곡선 Elsevier의 허가로 (1) 재판

그림 2. (A) 4개의 인간 또는 인간화 IgG₁ 항체, BIIB16, BIIB6, BIIB4 및 BIIB1에 대한 DSC 열 풀림 곡선 (B) IgG₁ 및 IgG₄ 형식의 BIIB7 항체에 대한 DSC 풀림 곡선 Elsevier의 허가로 (1) 재판

18개의 인간 또는 인간화 IgG 서열에 대한 Fab 안정성 측정

불변 영역이 동일하기 때문에 유사한 서브클래스의 IgGs는 안정성이 Fv 영역의 차이에 따라 달라집니다. 인간 또는 인간화 항체 특히, IgG₁에 존재하는 IgG Fab 안정성의 범위를 조사하기 위해 18개의 전장 인간 또는 인간화 항체(표시된 BIIB1–18)에 대한 패널을 사용하여 DSC 연구를 수행했습니다. BIIB7에 대한 DSC 추적에서 알 수 있듯이 Fab 전이는 CP_max 값(DSC 피크의 높이)이 C_H2 또는 C_H3 영역의 것보다 약 3배 정도 컸습니다(그림 1A). 4개의 인간 IgG 서브클래스에 대한 특성 DSC 추적이 그림 1B에 나와 있으며, IgG₁는 최고의 겉보기 항체 Fc 안정성을 보여 줍니다. 풀림 공정 중의 응집은 DSC로 측정한 Fab T_m에 영향을 미치므로(3,4) 각 항체에 대해 동일한 조건에서 DSC 스캔을 실시하고, 각 영역의 안정성을 비교 측정하기 위해 얻은 정보를 고려했습니다.

BIIB1-18 Fab 전이는 Fv 영역의 차이로 인해 상대적인 열 안정성이 상당히 달라졌습니다. 그림 2A에 나와 있는 DSC 곡선은 개별 Fv 영역이 다른 Fab 풀림 거동을 어떻게 유발할 수 있는지를 보여 줍니다. 18개 BIIB 항체의 Fab T_m 값 범위는 57.2°C ~ 81.6°C였습니다(표 1). 최저 Fab T_m 값을 가진 3개 항체(BIIB15-17)는 풀림에 대한 협동성 붕괴를 보여 주는 Fab에 대해 여러 풀림 전이를 나타냈습니다(BIIB16의 DSC 곡선은 그림 2A 참조). 이 항체에 대한 Fab 피크는 두 전이로 나누어집니다. T 값이 낮은 전이가 표 1에 나와 있습니다. C_H1/C_L의 풀림을 나타낼 수 있는 이차 전이가 BIIB15, BIIB16, 및 BIIB17에 대한 74°C, 72°C 및 70°C의 T_m 값에서 각각 발생했습니다.

DSC 연구는 크기 배제 크로마토그래피로 측정한 것과 같이 이상적인 헤테로테트라메릭 단백질로 수행했으나 1주간 2°C ~ 8°C 용액 속에 둔 경우 가장 불안정한 Fab를 가진 항체(BIIB17)는 제대로 발현하지 못했고 고분자량 응집체를 축적했습니다. 각 IgG₁의 C_H2 및 C_H3 풀림 전이가 중첩되었습니다(그림 2A의 대표성 있는 DSC 추적). 동일하게, 3개 IgG₄의 C_H2 및 C_H3 전이도 중첩되었습니다(데이터 표시되지 않음).

BIIB7은 IgG₁ 및 IgG₄ 둘 다로 구성했습니다. IgG₁ 및 IgG₄ C_H1 서열에는 10개의 아미노산 차이(6개는 보존성임)와 C_L을 갖춘 다른 이황화 결합 패턴이 있습니다. IgG₁ 및 IgG₄ 형식의 BIIB7에 대한 겉보기 Fab T_m 값은 피크에 대한 디콘볼루션 후 유사했습니다(ΔT_m < 1°C, 그림 2B). 이 유사성은 IgG₁과 IgG₄ 간의 Fab 열 안정성을 바로 비교할 수 있음을 보여 줍니다.

안정성 향상을 위한 Fab 잔여물 설계

단백질은 공통 설계(동족 단백질 서열에서 발견된 공통 아미노산에 대한 희귀 아미노산의 돌연변이)로 안정화될 수 있음이 밝혀졌습니다. 이를 뒷받침하여, DSC로 측정한 것과 같이 안정성이 가장 낮은 인간화 BIIB 항체는 최고 수준의 희귀 아미노산 유형을 갖추고 있는 것으로 나타났습니다. 항체 및 항체 분절 안정화 전략을 개발하기 위해 좋지 않은 거동의 Fab를 선택하고 Fab에 대한 안정성을 설계하기 위해 돌연변이 생성 캠페인을 실시했습니다. 파상풍 변독소(αTT)를 인식하고 인체로부터 유도한 Fab로 시작했습니다(5). 무작위 추출을 위해 45개의 잔여물 위치를 선택했습니다. 포화 돌연변이 생성 캠페인에 대한 전체 내용은 (2)에 자세히 설명되어 있습니다.

그림 3. V11(가장 안정적인 Fa)을 포함하여 다양한 돌연변이 조합이 포함된 12개 Fab 및 야생형 αTT Fab에 대한 DSC 분석 각 곡선은 표 2의 ΔT_m에 따라 도출할 수 있습니다. Oxford University Press의 허가로 (2) 재판

αTT Fab 라이브러리의 돌연변이 생성 및 열 내성 검사

45개의 돌연변이 PCR 반응은 개별적으로 변환되었고 4500개에 가까운 개별 군집을 선택하여 발현 매질이 포함된 96 웰 플레이트에서 배양했습니다. Fab가 포함된 상청액은 세 가지 별도 온도(70°C, 72°C 및 74°C)에서 열 공격을 받았습니다(2). 향상된 열 안정성을 나타내는 변종은 해당 특성을 확인하기 위해 열 내성 검사를 다시 실시했습니다.

안정화 돌연변이에 대한 전체 목록은 (2)에서 제공되어 있습니다. 라이브러리에서 약 1%의 변이는 향상된 열 안정성을 나타냈습니다. 14개의 "유효 물질"은 V_H 영역에, 나머지 4개는 V_L 영역에 위치했습니다. 이 결과를 통해 네이티브 Fab의 안정성은 V_H의 한계 안정성으로 제한됨을 알 수 있습니다. 놀랍게도, 2000개 이상의 구성원 불변 영역 라이브러리 내의 어떤 돌연변이도 Fab를 전체적으로 안정화하지 않는 것으로 나타났습니다. 불변 영역 내에서 안정화 돌연변이가 일어났으나 V_H 영역의 제한된 안정성으로 인해 Fab가 풀리고 해당 반응을 관찰하기 어려운 시점의 온도가 조절된 것으로 보입니다(아래 DSC 실험 참조).

C_L/C_H1 영역 내에서 안정화 돌연변이를 발견할 수 없는 이유는 상승된 온도에서 10분의 풀림 시간은 불변 영역이 완전히 풀리는 데에 충분하지 않기 때문입니다. Röthlisberger와 동료는 C_L/C_H1 헤테로다이머의 풀림은 매우 느리며(6) 4개 Fab 영역의 안정성은 이 반응 안정화로 인한 것임을 밝혀냈습니다. 따라서 불변 영역은 상대적으로 짧은 열 공격 기간 동안 풀리지 않을 수 있습니다.

많은 안정화 V_H 돌연변이는 공통 잔여물과 일치하지 않는 반면, 돌연변이의 대다수는 적어도 한 개 이상의 다른 V_H 생식 세포 서브클래스의 공통 잔여물과 일치했습니다(2). 예를 들어 TT V_H 내의 포지션 72는 아스파라긴에 대한 돌연변이로 최적화되었습니다. 생식 세포 V_H 서브패밀리의 공통 잔여물은 이소스테릭 아미노산 아스파르트산입니다. 잔여물 72에 대한 라이브러리 플레이트를 서열화한 후 아스파르트산은 우연히 발견되지는 않는 것으로 나타났습니다. 또한 V89는 대부분의 인간 V_H 서브패밀리에서 압도적인 공통 잔여물이지만 Val에 대한 돌연변이로 인해 Fab 안정성이 향상되지 않았습니다. 이소스테릭 V_H2 공통 잔여물 Thr은 검사에서 상당히 안정화되었습니다(ΔT_m > 2°C). 베타 분지 아이소류신은 검사에서 발견된 가장 안정화된 돌연변이 중의 하나였고, 인간 V_H 서열의 위치에서 종종 발견되나 V_H 서브클래스에 대한 공통 잔여물은 아닙니다.

4개의 안정화 돌연변이는 αTT V_L 영역 내에서 발견되었습니다. Ala(V_K1에 대한 공통 잔여물) 또는 His에 대한 V_K4 공통 잔여물 W50의 돌연변이는 상당히 안정화되었습니다. 히스티딘은 인간 카파 가변 영역의 포지션 50에서 드물게 발견되지만 인간 람다 가변 영역에서도 발견됩니다. 이 잔여물은 V_H/V_L 영역 경계에 가깝습니다. 특히 V_H 영역이 αTT Fab의 안정성을 제한하는 것으로 보이므로(2) Fab 안정성에 대한 기여도는 V_H 영역의 잠재적 버팀 효과와 연관될 수 있다고 가정했습니다. 그러나 고립된 V_L 영역으로 수행한 연구는 다른 결과를 보여 줍니다(데이터 표시되지 않음). Tyr에서 His까지의 돌연변이는 이황화물이 결핍된 scFv의 발현과 겉보기 안정성을 개선하는 것으로 보고되었습니다(7). 또한 잔여물 50의 거대한 방향족 그룹 즉, V_L 구조체 2의 C 터미널 잔여물은
다양한 사례에서 Fv 안정성에 적합하지 않은 것으로 보입니다.

αTT Fab를 통한 안정화 돌연변이 조합의 결과

돌연변이 초기 검사에서 확인된 3개 ~ 11개의 안정화 돌연변이를 포함하여 12개 구성물이 생성되었습니다(표 2). 각 돌연변이가 Fab 안정화에 제공하는 겉보기 기여도를 측정하기 위해 다양한 조합을 유도했습니다.

흥미롭게도, αTT Fab에 대한 여러 안정화 돌연변이를 도입한 경우 Fab 발현이 증가했습니다. 이 최고 구성물은 야생형에 대해 발현량이 3배 이상 지속적으로 증가했습니다(표 2). 각 Fab의 안정성은 DSC(그림 3) 및 원이색법(CD)으로 평가했습니다(데이터 표시되지 않음). DSC 및 CD 스캔은 일반적으로 비가역적이고 용액은 가열 후 상당히 탁했습니다. Fab의 응집으로 인해 측정된 T_m 값을 사용하여 겉보기 Fab 안정성에 대한 순위를 매겼습니다.

분자 내 및 분자 사이에서 이황화 결합이 이루어지는 경우 Fab의 일반적인 기능은 아니지만 일반적으로 4 영역의 풀림이 결합됩니다(1,3,6,8,9). 개별 영역의 고유 안정성 간의 상당한 차이에 따라 여러 영역 단백질의 풀림 반응이 결합되지 않는 것은 드문 경우가 아니며, 이 결합은 영역 간의 전체 상호작용 표면과 영역 상호 간의 친화도에 따라 달라집니다(10,11). Fab의 어떤 부분이 존재하지 않는 경우 나머지 영역의 풀림은 결합되지 않을 수 있습니다. Rowe 및 Tanford는 중연쇄에 연결되지 않고 그 대신 고립된
영역으로 풀리는 경우 카파 경쇄 내의 V_L 및 C_L이 결합되지 않고 변성한다는 것을 입증해냈습니다(12). 중연쇄에 대한 추가 접촉은 협동성에 필요한 것으로 보입니다. Röthlisberger와 동료는 안정성이 높고 유사한 가변 영역은 Fab의 네 영역에 대한 풀림 전이를 통합할 수 있는 반면, 상이한 안정성에 대한 가변 영역이 어떻게 서로 별도로 풀릴 수 있는지를 보여 주는 철저하고 명쾌한 실험 결과를 보고했습니다(6). 여기에 설명된 가장 안정적인 Fab 구성물(T_m = 92°C)은 가변 영역의 열 풀림 반응을 결합하지 않는 경계에 있는 것으로 나타났습니다.

12개 Fab 변종의 열 용융 온도를 사용하여 각 돌연변이에 대한 개별 안정성 기여도를 디콘볼루션했습니다. 몇몇 잔여물은 Fab의 일차 서열과 3차 접힘에서 서로 간에 상대적으로 근접해 있긴 하지만 모든 돌연변이가 Fab의 안정성에 기여하는 것으로 나타났습니다. 이 분석은 4개 돌연변이가 Fab 안정화의 86% 이하를 차지하고 있음을 보여 줍니다. V_H 영역 내의 g24A, T72N 및 F89I 돌연변이로 인해 Fab 구성물의 T_m 값이 각각 3.0°C, 2.8°C 및 2.8°C로 증가했습니다. V_L 영역 내의 W50H 돌연변이의 경우 Fab의 열 안정성이 3.5°C로 증가했습니다.

Fab 열 안정성은 대장 균에 의해 발현된 기능 단백질 분획과 관련되어 있습니다.

구조체 돌연변이 생성 후 고려해야 할 주요 사항은 αTT Fab의 항원 결합 기능에 미칠 수 있는 잠재적인 영향입니다. 열 안정화 돌연변이는 C_H1의 C 말단에서 C_L 영역과 히스티딘 태그를 검출하는 정량적 ELISA를 사용하여 원래 검사에서 유도했습니다. Fv 영역의 동적 특성이 항원 결합에 상당한 영향을 미칠 수 있다고 추정했습니다. Fv 구조체 영역에 도입된 안정화 돌연변이는 항원 도킹에 중요한 동적 균형을 방해할 수 있다고 우려했습니다.

열 안정화 돌연변이는 대장 균에 의해 발현된 분자 기능을 감쇠하지 않았지만, 실제로 기능 ELISA에서 αTT Fab의 겉보기 친화도를 향상시켰습니다(표 2). 두 개의 별도 야생형 Fab 조제물은 기능적 ELISA에서 항원으로 동일하게 적정하지 않았고, 세포 배양 중 작은 변형은 기능적 Fab 발현의 양을 민감하게 조절할 수 있음을 보여 줍니다. 두 야생형 조제물은 대부분의 안정화된 αTT Fab 구성물보다 더 기능적인 단백질을 산출했습니다. 각 Fab 변종의 기능적 용량은 T_m으로 설명한 것과 같이 안정성과 직접적으로 상관이 있는 것으로 나타났습니다(그림 4). 돌연변이가 예측된 결합 루프에서 떨어져 있으므로 이 잔여물이 항원과의 접촉을 강화할 가능성은 거의 없습니다.

야생형 αTT Fab의 거동을 바탕으로 대장 균에서 분비되는 Fab의 분획이 비기능적이거나 잘못 접힌 형태라고 생각합니다. 이러한 해석은 고립된 V_L 영역은 대장균에서 분비되면 cBL21trxB(DE3)의 산화 시토졸 환경에 발현된 V_L보다 매우 다양한 형태를 띈다는 사실과 상관되어 있습니다(결과 표시되지 않음). 또한 이는 Fab의 배치 생산에서 관찰된 기능적 변종을 설명해 줍니다.

그림 4. 각 Fab의 T_m을 Fab의 S자형 기능 ELISA 결합 곡선의 중간점 농도와 비교하는 플롯 Oxford University Press의 허가로 (2) 재판

개요

18개 인간 또는 인간화 항체의 열 풀림 프로파일은 DSC를 사용하여 측정했고 다양한 Fab 안정성을 밝혀냈습니다. 공통 설계를 사용하여, 안정성을 설계하기 위해 불안정한 Fab에 대한 포화 돌연변이를 생성했습니다. 열 공격 분석을 사용하여 Fab 라이브러리 검사를 하면 Fab의 11개 위치 내에서 19개의 안정화 돌연변이를 발견하게 됩니다. 안정화 돌연변이의 조합은 열 안정성(최대 92°C) 증가, 증가된 세균 발현, 상당히 감소한 수준의 잘못된 접힘 및 비기능적 물질을 유발합니다. DSC는 바이오치료법 개발에 적용할 수 있는 유용한 안정성 표시 기법이며 항체 안정성에 기여하는 요소를 신속하게 식별합니다.

감사의 글

이 응용 노트는 Stephen J Demarest, Ellen Garber, Gang Chen, Bruce E. Kimmel, David Gustafson, Jane Wu, Jared Salbato, John Poland, Marikka Elia, Xuqiu Tan, Ken Wong, Jay M. Short 및 geneviève Hansen(Biogen Idec, San Diego, CA US)이 작성했습니다.

참고 문헌

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