시차 주사 열량측정법으로 단백질 바이오 의약에 대한 액체 제형 개발 가속화

서론

단일클론 항체 개발 프로젝트는 다양한 임상 적응증을 위해 존재합니다(1,2). 단일 클론 항체를 포함하여 상업적으로 관심을 모으고 있는 재조합형 단백질은 바이오 의약을 성공적으로 개발하기 위해 생물학적 활성 이외의 추가 특성이 필요합니다. 특히 이 단백질은 응집되는 경향 없이 화학적 분해에 대한 저항성이 있으며 주어진 환경에서 물리적으로 안정되어야 합니다(3,4). 또한 적합한 혈청 반감기가 필요하고 잠재적인 면역원성(5)이 전혀 또는 거의 없어야 합니다.

액체 제형으로 생산하는 것보다 더 많은 비용이 들뿐만 아니라 동결 건조된 약품(DP)은 의사가 복원해야 하는데, 환자에게 비경구 투여하기 전 10분 ~ 20분 정도의 시간이 걸립니다. 바이오 의약 산업에서 기존의 동결 건조된 DP 대신 액체 제형 개발 자원에 초점을 맞추게 되는 주요 이유는 간소화된 투여때문입니다. 그러나 액체 제형과 관련하여 극복해야 할 몇 가지 기술적인 문제가 있습니다. 주요 과제는 물리적 안정성을 최대화하고 화학적 분해를 최소화하여 단백질 바이오 의약이 액체 제형에서 안정적인 상태를 유지하도록 하는 것입니다. 액체 제형은 주입 용량(1.0 ~ 1.5ml)으로 지정된 한계 농도를 보정하기 위해 가능한 높은 농도의 단백질을 포함해야 하기 때문에 특히 피하 투여를 위한 바이오 의약을 개발하는 것이 과제로 대두되고 있습니다(6).

그림 1: 액체 제형 개발 공정

제형 개발팀은 각 바이오 의약에 가장 적합한 미세 조절된 액체 제형을 제공해야 한다는 중압감을 갖고 있습니다. 재조합형 단백질, 특히 단일 클론 항체의 구조 및 안정성 분석은 바이오 의약 제형을 개발하기 위한 필수 요건입니다. 단백질 안정성에 대한 정보와 구조 정보를 얻는 데 사용할 수 있는 다양한 기법이 발전되어 왔습니다. DSC는 단백질 바이오 의약의 안정성을 연구하기 위한 주요 물리 화학적 방법 중의 하나입니다(7-11). DSC는 표지 또는 인공 프로브를 사용하지 않고도 단백질 풀림을 신속하게 연구할 수 있으며 단백질이 풀림에 따라 시료에서 흡수한 열을 확인하고 열 안정성을 측정한 다음 장기 안정성을 파악합니다.

특수 액체 제형 개발 프로그램은 바이오 의약에 최적화된 액체 제형을 효율적으로 전달하도록 설계되었습니다. 액체 제형 개발 공정에 대한 일반적인 과정이 그림 1에 나와 있습니다.

DSC는 액체 제형 개발의 초기 단계에 특히 유용한 것으로 입증되었고 원료 의약품(DS)을 보관해야 하는 제형의 수와 복잡한 분석에 걸리는 시간을 줄이는 데에 유용합니다.

재료 및 방법

DSC 실험은 주사 속도가 1.5 K/min인 Malvern MicroCal VP-DSC(Malvern Instruments)를 사용하여 실시했습니다. 시료는 분석 전 5분 동안 가스를 제거했습니다. 모든 실험에서 열랑측정계의 기준 셀은 시료 완충액에 상응하는 완충액으로 채웠습니다. 단백질 스캔에서 완충액 기준선을 제거하고 데이터 분석에 몰 열용량을 사용했습니다. 모든 단백질의 온도 유도 풀림은 가열 및 재가열 DSC 스캔을 비교하여 가역성을 확인했습니다(데이터 표시되지 않음). 가역성이 발견되지 않았습니다. 풀림 온도는 두 가지 상태 전이 모델에 따라 열량 측정 프로파일을 분석하여 얻었습니다. 100µg/ml의 항체 농도를 사용하는 경우 최적의 신호 대 잡음비가 발견되었습니다(그림 2). 높은 농도가 풀림 온도에 영향을 미치지 않지만 풀림 후 단백질 응집으로 인해 강력한 발열 열이 유도됩니다.

그림 2: 다른 농도에 대한 항체 1(IgG₁)의 풀림 전이

초기 단백질 특성 분석 단계의 DSC

특정 항체에 대한 액체 제형 개발 프로그램의 초기 단백질 특성 분석 단계에서 DSC를 사용하여 해당 항체와 개발 중인 다른 항체의 전체 안정성을 비교합니다. 그림 3에서 알 수 있듯이 다른 항체 간의 풀림 온도 측면에서 큰 차이가 발견될 수 있습니다.

그림 3: 항체 2(IgG₄, 200µg/ml), 항체 3(IgG₁, 100µg/ml), 항체 4(IgG₁, 100µg/ml)의 풀림 전이

대부분의 단백질과 같이 바이오 의약은 pH에 매우 민감하고 안정성을 극대화하기 위해 최적의 pH를 찾아야 합니다. DSC는 2주 및 4주간의 가속 안정성 연구를 실시하지 않고도 정보를 얻을 수 있기 때문에 pH 최적화에 효율적인 도구로 판명되었습니다. 대부분의 항체가 pH 5.5 ~ 6에서 최고의 안정성을 보여 주지만 편차가 발견되므로 최적의 pH 특성을 분석하는 것은 중요합니다. 그림 4 및 5는 융합 단백질과 항체 2의 pH 프로파일을 보여 줍니다. 그림에서 알 수 있듯이 융합 단백질의 최적의 pH(그림 4)는 pH 5이고 92.8°C의 T_m 값을 제공합니다. 융합 단백질은 pH 5 이상의 pH 값에서 순차적으로 불안정화되는데, 특히 낮은 pH 값에 민감합니다. pH 4에서 어떤 풀림도 관찰될 수 없습니다(데이터 표시되지 않음). 그림 5는 항체의 일반적인 pH 프로파일을 보여 줍니다. 가장 높은 안정성은 pH 5.5 및 pH 6에서 나타났고 78.5°C의 T_m 값을 확보했습니다.

그림 4: 융합 단백질(100µg/ml)의 pH 프로파일

그림 5: 항체 2(100µg/ml)의 pH 프로파일

그림 6은 시간 및 pH 함수로서 항체 2의 화학적 및 물리적 안정성에 대한 데이터를 나타낸 것입니다(초기 단백질 특성 분석 단계). pH 안정성 프로파일 연구는 ≤pH 5와 40°C에서 2주 및 4주간 항체 2를 배양한 후 안정성 측면에서 놀랄만한 변화가 일어났음을 보여 줍니다. DSC는 갓 전처리된 시료(시간이 0인 경우)만 사용하여 단일클론 항체에 가장 적합한 pH 조건을 구별할 수 있고 다른 방법과 유사한 결과를 제공합니다(그림 5). 또한 DSC는 ≥pH 6.5 값을 불안정화 상태로 파악했고, 이는 2주 ~ 4주의 기간으로는 명확하게 알 수 없지만 8주 ~ 12주 정도의 안정성 연구가 필요한 것입니다. DSC 결과는 제형 완충액의 pH를 최적화하기 위해 이 연구에 사용된 다른 방법의 결과와 상당히 일치합니다.

그림 6: (A) 크기 배제 크로마토그래피 SEC(응집), B) 아이소아스파르트산의 형성, (C) 레이저 광 산란(평균 분자 크기 증가)(D) 및 DSC(T_m)로 연구한 항체 2의 안정성에 미치는 pH 영향 아이소아스파르트산 값은 아이소아스파르트산/단백질의 양(아이소아스파르트산 몰 농도/단백질 몰 농도 × 100) 증가분에 따라 계산합니다.

DSC의 이점은 안정성을 파악하기 위해 시간이 0일 때의 시료만 분석한다는 것입니다. 이는 단백질을 가열하면 그 자체로 스트레스를 유발하기 때문입니다. 대개 네이티브 형태의 단백질이 안정화되는 경우 불안정화된 단백질이 견딜 수 있는 것 보다 높은 정도까지(높은 온도에서 풀림) 열 스트레스를 견딜 수 있습니다. 그러므로 DSC를 사용하여, 특정 액체 제형이 단백질 안정성에 미치는 영향에 대한 정보를 얻기 위해 다양한 온도에서 장기 안정성에 대해 시료를 시험할 필요는 없습니다.

액체 제형 개발(1차 검사)에 사용된 DSC

가장 유망한 액체 제형을 선택하기 위해 SEC, 레이저 광 산란(LLS), 모세관 전기영동법(CE) 및 SDSPAGE 등 다른 생물물리학적 방법과 함께 DSC를 항체 2의 1차 검사에 사용했습니다. 이 시료를 가속 안정성 연구에 사용하고 4주 후에 분석했습니다. DSC는 특히 항체 2에 부정적인 영향을 미치는 제형을 성공적으로 식별한 것으로 밝혀졌는데, 또한 양호한 액체 제형도 파악했습니다. 시간이 0일 때의 시료를 분석하여 DSC는 다른 분석 기법에 따라 불만족스러운 것으로 간주된 1차 검사에서 네 가지 액체 제형(제형 2, 6, 8 및 11) 을 식별했습니다. 그림 7은 서모그램을, 그림 8은 1차 검사의 액체 제형 F1 ~ F12에 있는 항체 2의 풀림 온도(T_m)를 나타냅니다. 제형 F9의 항체 2 풀림은 현저하게 기준에서 벗어난 풀림 패턴을 보였습니다. 이러한 이유로 주요 제형으로 간주되었습니다.

그림 7: 12가지 다른 제형의 항체 2 분석 서모그램

그림 8: 1차 검사의 항체 2(100µg/ml)의 T_m 값 회색 화살표는 이 연구에 사용된 다른 분석 기법에 따라 어떤 제형이 불만족스러운 것으로 간주되었는지를 나타냅니다.

결론

DSC는 단백질 특성 분석과 제형 개발의 초기 단계에 유용한 기술입니다. 단백질 안정성에 대한 주요 데이터를 신속하게 확보하여 액체 제형 개발 프로젝트를 지원하고 가속화하기 위한 안내서로 사용할 수 있습니다.

감사의 글

이 응용 노트는 Dr Fredrik Ollila(Novartis Pharma AG)가 작성했습니다.

참고 문헌

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