입자 크기 분포 분석의 특성은 해당 입자의 가중치를 계산하는 방식에 따라 다릅니다. 세 가지 분포 가중치 계산 방법, 즉, 개수, 부피, 강도를 일반적으로 사용합니다[1]. 강도 분포에서는 입자가 산란하는 빛의 양에 따라 입자의 가중치를 계산하며, 부피 분산에서는 입자가 차지하는 부피에 따라 입자의 가중치를 계산하고, 개수 분포에서는 농도에 따라 입자의 가중치를 계산합니다. 이 응용 노트는 단백질 제형에 적용할 경우 각 분포가 제공하는 정보와 각각의 가중치로 생성된 값을 연계 사용하여 시료의 특성을 이해하는 방법에 대해 실용적으로 설명합니다.
140µM 농도의 라이소자임과 50mM 농도의 아르기닌이 포함된 용액을 전처리하고 20nm 포어 크기 필터를 사용하여 여과하였습니다. 이 시료를 633nm He-Ne 레이저의 Zetasizer Nano ZSP를 사용하여 삼중으로 측정하였습니다. 1회 측정 시마다 15회를 실행하고 1회 실행 시 10초간 지속하였습니다. 측정 시 실온에서 173°의 산란 감지 각도를 이용하여 수행하였습니다.
그림 1은 데이터에 다른 가중치 계산 메커니즘을 적용하여 생성된 크기 분포를 나타내며, 표 1은 이러한 분포의 통계 설명을 나타냅니다. 아르기닌이 포함되지 않은 유사 시료에 대해 DLS(동적 광산란) 측정을 수행하는 동안 나노미터 미만의 피크가 감지되지 않았으므로 아르기닌이 0.6nm - 0.7nm 입자임을 확인할 수 있습니다.
라이소자임은 아르기닌보다 훨씬 크고 훨씬 더 많은 빛을 산란하므로 라이소자임의 농도가 아르기닌의 농도보다 0.5% 더 작은데도 불구하고 강도 분포의 대부분을 차지합니다. 아르기닌의 농도가 상대적으로 더 높다는 것은 부피 분포에 나타난 바와 같이 아미노산이 라이소자임보다 훨씬 더 많은 부피를 차지한다는 것을 의미합니다(개별 아르기닌 분자는 개별 라이소자임 분자보다 작음). 예상대로, 개수 분포는 거의 대부분 아르기닌이 차지하며, 라이소자임 분자 하나당 350개 이상의 아르기닌 분자가 존재하도록 용액을 전처리했습니다.
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| 피크 | 유체역학적 직경(nm) | %분포 기여도 |
|---|---|---|
| 라이소자임 | 4.18 ± 0.07 | 93.1 ± 0.8 |
| 3.69 ± 0.10 | 6.2 ± 2.1 | |
| 3.32 ± 0.11 | 0.0 ± 0.1 | |
| 아르기닌 | 0.66 ± 0.05 | 6.9 ± 0.8 |
| 0.64 ± 0.04 | 93.8 ± 2.1 | |
| 0.62 ± 0.04 | 100.0 ± 0.1 |
또한 개수 분포에서는 강도 분포보다 라이소자임 유체역학적 직경이 80% 미만인 것으로 나타나(표 1) 시료에 작은 라이소자임 올리고머가 있는 것을 보여 줍니다. 레일리 근사(Rayleigh approximation)에 따라 직경이 입사광 파장의 1/10 미만인 구형 입자가 산란시키는 빛의 양은 입자 직경의 6승에 비례하므로 이러한 올리고머는 강도 분포에 불균형적으로 큰 기여를 합니다. Zetasizer 소프트웨어에서 계산기를 사용하면 라이소자임 이량체는 유체역학적 직경이 5.0nm인 것으로 추정할 수 있습니다(구형 구조를 가정할 경우). 따라서 단일 이량체는 라이소자임 단량체보다 5배 이상 더 많은 빛을 산란할 것으로 예상할 수 있는 반면, 라이소자임 트라이머는 동일한 계산 방법을 사용할 경우 15배 이상의 빛을 산란할 것으로 예상됩니다. 따라서 이러한 올리고머는 단량체에 비해 각각 강도 분포에 5배, 15배 이상 기여합니다. 반면 시료에 들어 있는 다른 입자 크기의 상대적 농도만 측정하는 크기 분포에서는 그러한 편중이 없으므로 개수로 가중치를 계산할 경우 라이소자임 피크에 대한 평균 크기는 더 작습니다.
구형을 가정할 경우 입자 부피는 직경의 3승에 비례합니다. 이량체, 트라이머와 같은 작은 올리고머는 단량체보다 부피가 크기 때문에 강도 분포만큼은 아니지만 크기 분포에서 대부분을 차지합니다. 직경이 산란 강도에 미치는 영향과 입자 부피에 미치는 영향 간의 차이, 농도에 미치는 불충분한 영향은 부피 분포에 의해 확인된 유체역학적 직경 값이 강도와 개수 분포 간 중간 값인 이유를 설명해 줍니다.
반면, 분포 가중이 아르기닌의 계산된 유체역학적 직경에 큰 영향을 미치지 않는다는 사실(표 1)은 예상대로 아르기닌이 용액에서 응집되지 않는다는 점을 나타냅니다.
이 작업은 강도, 부피, 개수 분포 간 차이를 설명하는 것 이외에 Zetasizer Nano ZSP의 감도에 대해서도 설명합니다. 이 장비는 아미노산 중 상대적 분자 질량이 174D인 아르기닌의 유체역학적 크기의 반복적 측정 및 감지가 가능하다는 것을 보여주기 위한 예시로 사용되었습니다. Zetasizer Nano ZSP의 NIBS(비 침투적 후방 산란, Non-Invasive Back-scatter)방법은 14700Da의 단백질을 감지할 만큼의 감도를 제공하며, 173° 검출 각도는 큰 입자가 존재할때 상대적으로 작은 입자의 최대 해상도를 나타내도록 설계되어졌습니다.
마지막으로, 단백질 응집 분석에 대한 다양한 분포 가중치 값을 보여주고, 큰 입자의 강도-편중을 제거할 경우 단백질 피크의 계산된 유체역학적 부피가 감소되며, 그러한 편중은 아르기닌에 대해 측정된 크기에 거의 영향을 미치지 않습니다.
