이 응용 노트에서는 NanoSight의 NTA(나노 입자 추적 분석) 기술을 이용하여 나노 입자의 상태, 특히 나노 입자 및 생태 독성학 연구 이전 테스트 시료에 들어 있는 나노 입자의 크기, 크기 분포, 농도를 확인하는 방식에 대해 살펴봅니다.
공학용 나노입자(NP)는 위험성 평가와 관리에 대한 방법론보다는 개발 및 사용이 빠르게 이루어지고 있습니다. 나노 크기 입자의 새로운 특성은 나노 물질이 약속하는 성능의 기초입니다. 양산 제품에 관한 독성학은 잘 알려져 있지만, 동일한 물질이 나노화 되었을때 자동적으로 "상관 관계"가 있다고 가정하기는 어려우며 기본적으로 새로운 물질이라고 할 수 있습니다. 이러한 물질들이 장기적으로 잠재적인 어떤 독성 영향을 나타낼 것인가에 대한 인식이 증가하고 있으나 잠재적으로 환경에 미치는 영향에 대해 알려진 바가 거이 없습니다. 결과적으로, 공학용 나노 물질의 잠재적 독성 영향과 관련된 관심과 연구 활동이 증가하고 있으며 기존 제품 및 제형 내에서 나노 크기가 차지하는 부분의 중요성에 대한 검토가 이루어 지고 있습니다.
나노 독성학 연구를 시작하기 전, 사용한 나노 입자의 상태, 특히 적절한 테스트 환경에서의 크기, 크기 분포, 농도를 파악하는 것이 중요합니다.
입자 크기에 따라 확산 속도, 생물학적 장벽의 침투 또는 배제, 입자간의 상호작용이 결정됩니다.
이 노트에서는 생물학적으로 관련된 유체에서 금 나노 입자 및 해당 응집체의 특성 분석에 NTA(나노 입자 추적 분석)를 적용하는 방법에 대해 논의하고자 합니다. NTA에서는 기존 광 산란 기법을 보완하여 입자 대 입자 기준으로 현탁액의 나노 입자의 크기와 수를 측정할 수 있어 응집에 대한 이해가 가능합니다. 이 연구에서는 금 나노 입자의 크기의 변화를 살펴보고 표준 분산 용매(구연산염 완충액)의 사례를 희석된 혈장(단백질 포함)과 비교해 봅니다(NIST 2007).
건강한 헌혈자에서 채혈합니다. 튜브를 800RCF에서 5분간 원심 분리하여 적혈구와 백혈구를 분리했습니다. 상층액(혈장)을 튜브로 옮기고 라벨링하여 -80˚C에 보관했습니다. 해동한 혈장을 다시 16.1kRCF에서 3분간 다시 원심 분리하여 남은 적혈구와 백혈구를 추가로 분리했습니다. 분리된 층이 손상되지 않도록 주의하면서 상층액을 새 용기로 옮겼습니다.
60nm의 NIST 금 표준 나노 입자를 사용했습니다(NIST 표준 물질 8013). 이 입자를 관련 조사 보고서(NIST 2007)에 따라 보관, 전처리하여 사용했습니다. pH 7.19의 표준 구연산염 완충액을 사용하여 금 입자를 약 108개/mL의 농도로 희석했습니다. 혈장 분산을 위해 인간의 혈장을 구연산염 버퍼에서 1:106 으로 희석하고 10µL의 금 나노 입자를 790µL의 희석된 혈장용액에 첨가했습니다.
NanoSight LM10에서 나노 입자 추적 분석을 진행했습니다. 모든 시료 전처리 및 측정은 아일랜드의 더블린대학에서 수행했습니다. 통계적 정확성을 보장하기 위해 각각 166초 분량의 비디오를 여러번 배치 모드로 녹화하여 분석했습니다. 혈장은 자연적 이온 분산매이므로 단백질 응집이 항상 문제가 될 것임에 주목했습니다.
나노입자를 구연산염 버퍼와 인간 혈장에 희석할 경우 크기와 농도를 확인하기 위해 비디오를 녹화(그림 1)하고 추적하여 분석했습니다.(그림 2).
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구연산 버퍼에 희석된 금 입도 측정 방법은 참조 자료 보고서(NIST 2007)의 방법을 따랐습니다.
NTA를 사용하여 시각적, 그리고 농도 측정을 통해 입자가 아직 단분산 되어 있는것을 확인함으로써 현탁액 내의 나노 입자에 크기 증가는 응집이 아니라 단백질 막 형성으로 인한 것이라는 가정을 뒷받침 할 수 있습니다.
그림 1, 2에서 확인된 나노 입자는 약 10nm의 크기변화가 있음을 알 수 있으며, 그 중, 5nm 두께의 나노 입자에 흡착된 단백질 층에 해당합니다.
인간 혈장과 같은 생물학적 분산매가 존재할 경우 단분산 금 나노 입자의 입자 크기 분포가 측정 가능한 수준으로 크게 변합니다. 본 응용노트에서는 나노 입자 추적 분석(NTA)을 이용한 혈장 층의 두께를 측정하는 적절한 방법을 설명하였습니다.
NTA를 이용하여 측정된 구연산에 분산 입자의 크기와 평균입도는 NIST에서 제공한 값과 유사합니다. 혈장이 존재할 경우 입자 크기와 입자 크기 분포 모두 유사하게 증가합니다.
NTA는 절대 농도 측정 방법을 제공하며, 이 방법으로 NIST 금 나노 입자의 갯수 농도 확인도 가능합니다 또한 이량체(Dimer)와 같은 나노 입자 응집체를 식별 및 계수하는 데 적합합니다. 따라서 개발된 나노 물질들을을 바이오 나노 과학 및 바이오 나노 상호작용에 사용되고 있는 기존 기술과 더불어 (여기에 사용된 나노 입자 및 농도 영역에 대해) 유용한 도구가 될 수 있습니다.
NTA는 나노 입자 크기와 농도에 대한 정보를 제공하는 분석적 방법으로 인식되어 왔으며 높은 분산성의 복잡한 시료 유형에서도 동일하게 활용할 수 있습니다(Montes-Burgos 외, 2010, Lynch, 2008, Montes-Burgos 외, 2007). NTA와 같은 방법은 미래에 나노 입자의 환경적 영향과 잠재적 세포 독성을 연구하는 방법 중 하나로 생각해 볼 수 있습니다(Borm 외, 2006, Tenuta, 2008, Tran 및 Anton, 2009, Kuhlbusch 외, 2010, Hassellöv 및 Kaegi, 2009, Stolpe 외, 2011).
최근 연구에서는 나노입자와 환경 매트릭스 사이의 상호작용이 매우 복잡하여 수량화 및 모델링뿐만 아니라 NTA에서 조사 및 분석의 메커니즘을 제공하는 방식이 매우 어려운 것으로 나타났습니다(Gornati 외, 2009, Hartmann, 2011, Arvidsson 외, 2011, Howard, 2010, Njuguna 외, 2011, Tran 외, 2009).
해양 무척추 종의 초기 성장에서 원자가가 0 나노 철(nZVI)에 적용된 코팅막에 효과에 관한 연구에서 Kadar 외 여러 명(2012)은 NTA를 사용하여 해수에서 nZVI의 분해를 연구하여 이 코팅막이 나노 금속 현탁액을 안정화하는 데 도움이 된 것을 보여 주었습니다 Kadar는 또한 NTA로 분석한 산업 관련 합성된 철 나노 입자가 해양 미세 조류 배양의 성장 및 대사 상태에 미치는 영향도 연구하고, 성장 속도, 크기 분포, 지질 개요, 세포 초미세구조의 후속 변화에 대해 설명했습니다(Kadar 외, 2012).
Poynton 외 여러 명(2012)은 일반적인 독성 지표 종인 민물 갑각류와 물벼룩에 15k 올리고핵산염 마이크로어레이를 사용하여 입자 독성과 은 이온의 독성을 확인하고 노출바이오마커들로 개발된 구연산염과 폴리비닐피롤리돈(PVP)이 코팅된 나노입자를 게놈 수준에서 독성을 연구하기 전에 NTA로 은 나노입자의 응집 수준을 확인했습니다.
Waalewijn-Kool 외 여러 명(2012)은 장님마디 톡토기(Folsomia candida)에 대한 산화 아연 나노 입자의 독성에 대한 연구에서 노출 매체를 섞는 방법을 다르게 할 경우 분산된 크기에 따라 유기체의 번식 능력이 거의 달라지지 않은 것을 확인 할 수 있으며, NTA와 TEM 모두 산화 아연의 독성이 입자 크기와 관련이 없는 것으로 나타났습니다.
NTA는 세포 수준에서 인체 말초 백혈구(Colognato 외, 2008)와 쥐 섬유아세포(mouse fibroblasts,Ponti 외, 2009)의 유전 독성을 연구하는 데 유용한 것으로 증명되었습니다. 나노 입자가 인간의 태반을 통과하는 능력(Wick 외, 2009)과 인체 피부를 통해 산화 규소의 안반의 이동(Staroňová 외, 2012)을 포함하여 다른 생물학적 경계에 미치는 다른 영향에 대한 방법(Linn 외, 2010)이 다루어졌습니다. Similarly, Filon et al. 여러 명(2012)은 정상 피부와 손상된 피부를 통한 코발트 나노 입자의 인체 피부 침투성에 대해 보고하면서 나노화된 코발트 입자가 체외 확산 시스템에서 인체 피부를 침투할 수 있다는 것을 제시했습니다.
세포 독성 시험을 위해 세포에 입자를 적용하기 전 크기 분포에 대한 이해가 반드시 선행되어야 하며 NTA는 이 점에서 유용성을 입증받았습니다(Kendall 외, 2009, Patel 외, 2010, Munaro, 2010, Karlsson, 2010). 다양한 종류의 나노 입자와 혈청(Treuel 외, 2010), 유기 오염 물질(Ben-Moshe 외, 2009), 디티오트레이톨(Sauvain 외, 2008) 등 생물학적 기원의 다양한 매트릭스와의 상호작용에 대한 연구도 진행되었습니다.
코발트 나노 입자(Co-NPs) 응집체의 독성 영향을 검사하고 폐, 간, 신장, 장 및 면역 체계를 나타내는 다양한 세포를 사용하여 코발트 이온의 독성 영향과 비교하였습니다. 전반적으로 확인된 결과는 응집된 코발트 나노입자의 독성 영향이 주로 응집된 나노입자에서 분해된 코발트 이온으로 인한 것이라는 가정과 일치합니다. (Limor 외, 2011).
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