엑소좀과 미세소포: NTA를 이용한 농도, 크기 측정 및 표현형

서론

미세소포와 나노미터 크기의 베지클(엑소좀)이 바이오 마커로 활용 가능성이 증가되면서 이들에 대한 관심이 집중되고 있습니다. 현재 새로운 분야에 대한 정의나 규정은 명확하지 않지만, 바이오 나노입자는 크기 범위와 생체내 합성 여부에 따라 분류하고 있습니다. 일반적으로 미세소포는 100nm~1μm의 직경을 갖는 반면 엑소좀은 30~100nm의 직경을 갖는 것으로 알려져 있습니다. 미세소포는 일반적으로 플라즈마 멤브레인의 소포에 의해 형성되는 반면 엑소좀은 엔도좀의 다포성소체(multivesicular)로부터 엑소사이토시스에 의해 생성됩니다. 이들 모두 다양한 신호 단백질뿐 아니라 메신저인 RNA와 microRNA 분자 신호를 운반하는 세포 신호 전달에 관여하는 것으로 보입니다. 동맥 경화증, 관상 동맥 질환, 혈액 및 염증 질환, 당뇨병, 암 등의 다양한 질환에서 순환 수치의 상승이 확인되었습니다.

현재까지 엑소좀 연구는 특성 분석에 적합한 방법이 없기 때문에 제한되어 왔습니다. Malvern의 NanoSight는 검증된 기술로 이러한 요구를 충족할 수 있습니다. 나노 입자 추적 분석(NTA)은 현탁액(liquid suspension) 내 직경 50nm~1000nm 범위의 특정 엑소좀과 미세소포를 각각 시각화하여 실시간으로 볼 수 있게 해줍니다. 동시에, NTA는 고분해능의 입자 크기 분포 프로파일과 농도 측정 결과를 제공합니다. 이 기술은 사용하기 쉽고, 빠르고, 정확하며 비용대비 매우 효과적으로, 기존의 방법을 쉽게 보완할 수 있습니다. 형광 모드에서는 다양한 여기 파장을 사용하여 적절하게 표지된 입자의 특성화 및 구별을 가능하게 합니다.

세포외 소포체의 농도 검출 및 측정

동적 광산란(DLS)과 NTA 모두 운동 속도 또는 확산 계수(Dt)가 스토크-아인슈타인 방정식을 통해 입자 크기와 관련이 있는 나노 입자의 브라운 운동을 측정합니다.

NTA를 사용하여 레이저 빛은 현탁액 내의 입자를 조사하고 비디오 카메라는 생성된 산란광을 획득합니다. 2차원적으로 개별 입자의 위치 변화를 추적함으로써 확산 계수가 결정됩니다. 확산 계수(Dt)를 알고 있다면 입자의 유체역학적 직경을 계산할 수 있습니다.

브라운 운동에 따라 이동하는 입자는 다음 그림에 있습니다. 초기 큰 입자 또는 응집된 물질이 있는 것을 육안으로 확인할 수 있습니다(그림 1a). NTA 소프트웨어는 입자별로 고해상도 크기 분포와 보이는 소포 수(절대 수 농도 환산)를 빠르게 생성합니다(그림 1B).

그림 1*. 혈소판 없는 플라즈마 희석 시료. A) NanoSight 기술로 측정된 전형적 이미지. 생성된 이미지는 사용자가 즉시 농도와 다분산성 수준 등 시료에 대한 특징들을 확인할 수 있게 해줍니다. B) 입자 크기 분포와 시료로부터 계산된 원래 농도. *출처: C Gardiner¹, R Dragovic¹, A Brooks¹, D Tannetta¹, D Redman², P Harrison², and I Sargent¹ (2010) Nanoparticle Tracking Analysis for the Measurement and Characterisation of Cellular Microvesicles and Nanovesicles, Proc NVTH BSTH 2010.
¹Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford
²Oxford Haemophilia & Thrombosis Centre, Churchill Hospital , Oxford, UK

대체 기술

전통적으로 미세소포와 나노미터 크기의 베지클의 특성을 분석하기 위하여 마이크로 입자 분석을 위한 기술들이 사용되어 왔습니다. 설정 대상은 다음과 같습니다.

• 유세포분석기
• 동적 광 산란(DLS)
• 전자 현미경(EM)
• ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays)

위의 기술 중 가장 널리 사용되는 기술은 유세포분석법입니다. 일반적으로 상용화된 유세포분석기는 폴리스티렌 비드를 기준으로 300nm 이하에서는 노이즈와 신호를 구분할 수 없어 실용성이 떨어집니다. 이러한 검출 한도는 형광 라벨을 사용함으로써 확장할 수 있지만 검출 한도가 낮을 경우 그러한 입자 크기를 정확히 측정할 수 있는 능력은 상당한 제한을 받습니다. DLS 또한 동일한 응용분야에서 사용되며 단분산 시료의 경우 정확한 크기 정도를 제공할 수 있습니다. NTA는 DLS의 평균 입자 크기와 더불어 고분해능의 입도분포에 대한 추가 정보를 제공할 수 있습니다. 전자 현미경은 미세소포와 나노미터 크기의 베지클 연구에 유용한 연구 도구이지만, 높은 운영비, 많은 노력을 필요로 하는 시료 준비, 느린 측정 시간 및 시료 준비 후 시료 무결성이 담보되어야 합니다.

측정의 선택성

특정 크기 또는 크기 범위의 입자가 시료에 존재하는지 측정하는 것이 적절하지만 종종 시료 내 하위 입자(sub-populations)에 대한 식별 및 구별하는 값을 추가할 수 있습니다. NanoSight 기술은 항체에 형광 라벨을 사용하여 선택적으로 분석할 수 있습니다. 이 접근법은 사용자가 적절한 광학 필터를 사용하여 제외할 수 있는 주변의 불특정 입자와 함께 형광 표시 항체가 귀속된 특정 비미립자만 검출 및 분석할 수 있게 해줍니다. 각종 형광체를 사용할 수 있지만, 최적의 결과를 얻기 위해서는 효율성과 안정성이 우수한 양자점 라벨을 사용하는 것이 유리합니다.

이 기술은 적절한 보라색 레이저 다이오드(405nm)가 장착된 NanoSight 장비에 의해 여기된 양자점 형광체로부터 방출된 형광 비디오 프레임을 그림 2A에 나타내었습니다. 특정 항체(NDOG II)에 이 양자점을 라벨로 사용하여 합포체영양막 미세소포(syncytiotrophoblast microvesicle, STBM)를 표시하는 바이오마커로 이용되어 왔습니다.

그림 2B는 i) 산란(비형광)에 의해 검출된 STBM 시료(파란색 선)에 있는 모든 입자, ii) 형광 모드(빨간색 선)에서 측정된 것처럼 형광 QDot으로 표시된 NDOG II 항체가 결합되는 입자, iii) 유사한 QDot으로 표시된 항체로 구성되었지만 항체가 STBM(형광 모드로 측정)에서 표적 바이오마커에 대하여 친화성이 없는 입자(녹색 선)로 3가지 크기 분포를 나타냅니다. 이것은 시료에 존재하는 입자의 대다수가 STBM에 Q-Dot-NDOG II 항체에 의해 성공적으로 결합되었음을 확인할 수 있으며, 대조군이 매우 낮은 신호로 그렇지 못함을 나타내고 있습니다.

그림 2*. A) 항체를 통해 STBM 입자에 연결된 양자점의 형광 이미지. B) 시료 전체의 입자 분포(파란색), 항체가 결합된 STBA의 입도분포(빨간색), STBA와 반응하지 않은 순수 항체(대조군, 녹색)의 입자 분포. Y축은 갯수 농도입니다.

결론

NTA는 낮은 농도에서도 미세소포와 나노좀의 크기 및 농도를 측정할 수 있으며, 형광 라벨과 함께 사용하더라도 복합 시료에 존재하는 특정 유형의 입자를 선택적으로 선택 및 분석할 수 있습니다.