나노 입자 추적법을 이용한 단백질 응집의 시각화, 고해상도 크기 및 농도 측정

서론

단백질 응집은 제조 공정의 모든 단계(세포 배양, 정제, 제형), 제품의 보관, 유통 및 취급에서 발생할 수 있습니다. 단백질 응집은 뒤섞기나 극한의 Ph, 온도, 이온 강도, 다양한 경계(예: 공기-액체 경계)에 대한 노출과 같은 다양한 유형의 스트레스로 발생할 수 있습니다. 단백질 농도가 높을수록(일부 바이오 치료제의 경우) 응집 가능성이 더욱 높아질 수 있습니다.

바이오치료제 시료에서는 다양한 크기와 특성(예: 용해성, 비용해성, 공유 결합, 비공유결합, 가역성, 비가역성)의 응집체가 나타납니다. 단백질 응집체는 작은 올리고머(나노미터)부터 수백 개의 단량체 단위를 포함할 수 있는 비용해성 마이크론 크기 응집체까지 다양한 크기가 있습니다.

조제물을 개발, 제조, 보관하는 동안 응집에 대한 특성을 주의하여 분석하고 관리해야 합니다. 마찬가지로, 응집 상태를 모니터링함으로써 생산 공정을 변경 또는 최적화할 수 있습니다.

NTA(나노 입자 추적 분석)

NTA(나노 입자 추적 분석)는 브라운 운동의 속도와 입자 크기에 따라 입자를 시각화 및 분석하는 방법입니다(그림 1). 운동 속도는 액체의 점성, 온도, 입자의 크기와만 상관 관계가 있으며, 각 입자의 크기를 개별적으로 측정하여 고해상도 입자 크기 분포를 생성하는 동시에 시료에 있는 입자의 농도를 제공합니다(그림 2). 단백질의 낮은 굴절률로 인해 NTA 측정의 탐지 하한은 직경 약 30nm입니다. 즉, 일반적으로 3nm - 10nm인 단백질 단량체 단위는 NTA로 측정할 수 없지만, 몇 십 내지 몇 천 단위의 단량체로 구성된 응집체는 크기와 개수를 측정할 수 있습니다. 일반적으로는 입자 크기 분포를 얻기 위해 시료를 희석할 필요가 없으므로 시료 전처리로 인해 응집 프로필이 변경되지 않습니다.

그림 1. NTA 기법으로 만든 일반적 이미지 이미지를 사용하여 시료에 대한 특정 특징 및 응집체의 존재 여부를 바로 확인할 수 있습니다.

그림 2 그림 1에 표시된 시료로 작성한 입자 크기 분포(숫자 분포).

예제 1 - 전단응력

다음 예제에서는 직경 45nm에서 NTA로 바이러스를 정확하게 측정하였습니다(그림 3a). 하지만 동일한 시료를 몇 초간 단순히 휘저은 다음 전단 응력으로 바이러스 시료에 응집이 나타났습니다(그림 3b).

그림 3. 전단 응력으로 응집이 나타나기 전 (a) 및 후 (b) 바이러스 시료의 입자 크기 분포 프로필 정규화된 수식 축에서 척도가 변경된 것은 응집 입자 농도가 감소한 것을 나타냅니다(약 80x10⁷ 입자/mL에서 약 50x10⁷ 입자/mL).

출처: Moser M., (2008) 백신 특성 분석을 위한 새로운 분석 기법, 생산 국제 컨퍼런스 백신, 유럽 브뤼셀, 2008년 12월.

예제 2 - 열 응력

열(50^oC)을 사용하는 이 예제에서는 시간의 경과에 따라 1mg/mL의 IgG가 응집되었고 638nm 레이저를 장착한 NS500에서 광산란 입자의 수와 농도가 증가하는 것이 관찰되었습니다. 각 시간대에서 NTA와 DLS(동적 광산란) 측정을 수행하고 단량체와 응집체의 크기 데이터를 모두 관찰할 수 있었습니다(그림 4). 열에 의해 응집된 후 20분이 경과되면 DLS로 설명된 단량체 피크에 유체역학적 직경이 약 10nm와 동일한 구가 표시되고, NTA에서 측정한 응집체 입자는 약 30nm부터 시작하여 50nm 및 85nm에서 피크가 관찰되었고 최대 응집체는 약 300nm로 측정되었습니다. NTA는 입자 농도도 측정 가능하므로 열 응집 중 입자 수의 증가도 추적할 수 있습니다(그림 5). 이 데이터는 최초 30분 동안 크기가 30nm를 초과하는 응집체가 매우 적다는 것을 나타냅니다. 30분부터 100분까지, 30nm 이상의 응집체 수는 안정적으로 유지되며 100분 이후부터 응집체 수는 더욱 기하급수적으로 증가합니다. 동일한 시료의 NTA 및 DLS 데이터와 NTA 농도 데이터를 사용함으로써 단백질 응집의 복잡한 영역을 연구할 때 풍부한 정보의 해법을 얻을 수 있습니다.

Figure 4 시간의 경과에 따른 IgG의 응집

Figure 5 NTA로 측정한 시간의 경과에 따른 IgG의 응집 

예제 3 - 고농도 시료

단백질 생산 기법은 150mg/mL 이상에서 점점 더 높은 농도의 스톡을 생산하는 경향을 보이고 있습니다. 시료 챔버에 50 mg/mL, 100 mg/mL, 150 mg/mL의 BSA 시료를 적재했습니다. 농도가 증가함에 따라, 비분해성 단량체 및 작은 응집체로 인해 관찰된 산란이 증가하지만 NTA는 여전히 직경이 약 40nm인 응집체를 식별 및 추적할 수 있습니다(그림 6).

Figure 6 50 mg/mL, 100 mg/mL, 150 mg/mL BSA 시료의 NTA 비디오 프레임 및 크기 분포 프로필

최근 문헌 예제

NTA를 사용하여 알파키모트립신의 크기 3상 분할 및 크기 분포에 사용된 황산 암모늄의 백분율의 영향 조사(Rather 외, PLoS ONE, 2012. 7(12): e49241. doi:10.1371 /journal. pone.00492410).

Torosantucci 외 여러 명은 NTA를 사용하여 인슐린의 구리/아스코르브산 유도 응집에 대한 다양한 항산화제의 영향을 조사하여 비응집 상태 대비 크기 분포 프로필을 만들었습니다(Torosantucci 외, Eur J Pharm Biopharm. 2013년 8월, 84(3):464-71. doi: 10.1016/j.ejpb.2013.01.011. Epub 2013년 2월 9일).

결론

과학자들은 단백질 치료제에 환자에게 부적절한 큰 응집체가 발생하지 않도록 단백질 단량체 단위의 합성, 정제, 포장, 운송, 보관, 사용 공정에서 응집이 시작되는 위치를 이해해야 합니다. 과학자들은 공정의 여러 위치에서 NTA 및 DLS를 이용한 크기 분포를 측정함으로써 응집이 시작되는 위치를 식별할 수 있습니다. 그런 다음 이 위치/단계를 검토하고 필요 시 수정하여 단백질 응집체의 형성을 방지 또는 둔화할 수 있습니다.