치료용 재조합 항체, 그 중에서도 주로 면역글로불린 G (IgG)(그림 1) 계열이 바이오 의약에서 차지하는 비중이 커지고 있습니다. 또한 암, 류마티스 관절염, 당뇨병과 같이 다양한 현대 질병을 치료하는 승인된 항체 요법의 수가 계속하여 늘고 있습니다. 바이오 의약 개발 파이프라인에 다양한 여러 후보 IgG가 오름에 따라 이러한 후보를 정확하게 이해하고 개발해야 할 필요성이 점차 커지고 있습니다.
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단백질 응집은 오랜 기간 바이오 의약 산업의 주요 화두였습니다. 단백질은 보관 수명이 제한적이고 시간 경과에 따라 침전되며 혈류에 응집된 단백질이 있으면 능동/적응 면역 반응이 정기적으로 활성화될 수 있음이 입증된 바 있습니다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 일반적으로 단백질 제제의 응집체를 평가하기 위해 사용하는 정립된 효과적인 도구입니다.
SEC는 단백질을 크기에 따라 분리하며 주로 분자량을 측정하고 응집 단백질 시료를 식별하기 위해 사용됩니다. 대부분의 SEC 시스템은 하나의 검출기(예: 자외선(UV) 흡광도 검출기)를 사용하지만 광 산란 검출기를 추가할 경우 단백질 분자량의 검출이 가능하며 머무름 부피에 상관 없이 단량체, 이량체, 응집체를 서로 구분할 수 있습니다. 광 산란은 흡광도 측정에 비해 훨씬 응집체 형성에 민감하며 다른 방법으로는 놓치기 쉬운 응집체를 검출할 수 있습니다. 이용하는 광 산란 검출기가 다각도 광 산란(MALS) 검출기인 경우 빛을 비등방성(고르지 않은 각도)으로 산란시키는 대용량 응집체의 회전 반경(Rg)을 측정하는 데에도 사용할 수 있어 추가적인 구조/형상 정보를 얻을 수 있습니다.
Viscotek SEC-MALS 20 시스템(그림 2)은 20 각도 광 산란 장비로서 용리 용적과 상관 없이 단백질 및 단백질 응집체 분자량을 측정할 수 있습니다. 이 응용 노트에서는 SEC를 사용해 정제된 다클론 항체(IgG)를 분리하고 Viscotek SEC-MALS 20을 사용해 그 특성을 분석합니다.
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농도를 측정하기 위해 TDA RI 검출기를 사용해 SEC-MALS 20 검출기와 Viscotek TDAmax 시스템을 연결하였습니다. 시료는 2 x Viscotek 단백질 컬럼으로 분리하였습니다. 이동상은 PBS였고 IgG 시료를 이동상에 녹여 준비하였습니다. 검출기 및 컬럼은 모두 효과적인 분리와 기준선 안정성의 극대화를 위해 30°C로 유지하였습니다.
그림 3은 Viscotek SEC-MALS 20을 사용해 IgG 시료의 특성을 성공적으로 분석했음을 보여줍니다. 그림 4에는 다양한 MALS 각도의 데이터가 나와 있습니다. 계산된 분자량은 표 1에서 확인할 수 있습니다.
| 응집체 | 다이머 | 모노머 | |
|---|---|---|---|
| Peak RV - (ml) | 13.23 | 14.00 | 15.80 |
| Mn - (kDa) | 674.12 | 308.6 | 147.2 |
| Mw - (kDa) | 7661.00 | 309.2 | 147.4 |
| Mw / Mn | 11.364 | 1.002 | 1.001 |
| Rg(w) - (nm) | 26.6 | N/C | N/C |
| Wt Fr (Peak) | 0.014 | 0.065 | 0.921 |
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결과를 통해 이 정제된 IgG 시료가 실제로 매우 복잡하며 3개의 피크로 분리됨을 알 수 있습니다. 주피크에서 측정된 분자량은 147kDa입니다. 이는 IgG 분자량에 매우 근접한 값으로서 이 시료는 단량체의 IgG로 명확하게 식별됩니다. 2차 피크에서 측정된 분자량은 300kDa를 약간 넘은 값으로서 이량체로 명확하게 식별됩니다. 두 피크 모두에서 분자량이 매우 안정적이므로 단분산계로 파악됩니다. 이를 통해 여기에서 연구한 단량체 및 이량체 형태의 IgG는 분자량 및 구조 측면에서 제대로 정의되었음을 알 수 있습니다.
하지만 세 번째 피크의 경우 상당한 차이가 있습니다. 광 산란 신호가 굴절률 신호보다 훨씬 크며 그에 따라 높은 분자량을 갖고 있습니다. 분자량이 약 600kDa부터 최대 7x104kDa에 이르는 등 매우 가변적입니다. 해당 피크는 다분산성 값(Mw/Mn)에서 알 수 있듯 강한 다분산계로서 이 피크의 분자량 범위가 매우 넓음을 알 수 있으며 이 피크는 특정할 수 없는 응집체임을 짐작할 수 있습니다. 응집된 이 IgG 분자의 활성도가 대부분 또는 완전히 사라질 가능성이 있습니다.
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농도 검출기를 통해 개별 모집단을 수량화할 수 있습니다. 해당 분포 역시 표에 표시됩니다. 단량체 피크가 시료의 92%를 구성하는 반면 이량체는 시료에서 단 7% 밖에 찾아볼 수 없습니다. 대용량 응집체는 시료의 2% 미만을 차지합니다.
SEC 및 MALS 표준에 따르면 상대적으로 작은 분자에 해당하는 단백질입니다. 가용성 단백질은 일반적으로 반경이 10nm 미만인 등방성 산란체이기 때문에 MALS를 사용해 Rg를 측정할 수 없습니다. 이는 여기에서 측정한 단량체 및 이량체 형태의 IgG에도 적용됩니다. 하지만 일부 대용량 응집체는 비등방성 산란체에 해당할 만큼 커서 Rg가 측정됩니다. 그림 4를 연구하면 응집체 피크의 산란에서 각의존성을 확인할 수 있습니다. 이를 분석하면 평균 26.6nm의 Rg를 얻게 됩니다. 그림 5는 응집체 피크 최상위에서 얻은 해당하는 Zimm 플롯을 보여줍니다. 그림 6에 표시된 단량체 피크의 최상위에 해당하는 Zimm 플롯은 IgG 단량체가 등방성 산란체임을 명확히 보여줍니다.
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이 응용 노트는 Viscotek SEC-MALS 시스템을 사용한 IgG 분자량의 성공적인 측정에 대해 설명하고 있습니다. 이 장비는 단백질의 용리 용적 또는 구조와 상관 없이 단백질 분자량을 측정할 수 있으며 비등방성 산란을 표시할 만큼 큰 분자를 지닌 Rg 형태의 경우 분자 크기도 측정에 문제가 되지 않습니다. IgG 단량체 및 이량체의 분자량을 성공적으로 측정했으며 IgG 응집체 분자량 및 Rg의 특성 또한 분석했습니다. SEC-MALS 20은 SEC 장비에 추가하여 사용할 수 있는 완벽한 검출기로서 시스템에 고품질 MALS 기능을 제공하여 단백질 분자량의 직접적인 측정이 가능합니다.
