Zetasizer Nano는 유체역학적 크기와 전기영동 이동도의 측정을 위한 동적 광 산란과 전기영동 광 산란 기술 분야에서 시장을 주도하는 제품입니다. 동적 광 산란(DLS)은 단백질과 그 제제의 특성 분석을 위해 널리 사용되고 있는 방법으로 이 방법을 이용하면 분자의 크기 측정뿐만 아니라 안정성 평가도 가능합니다. 최근, 단백질이 생물학적인 치료제로의 사용이 급격히 증가면서 용액 내 단백질의 안정성이 과학적으로나 상업적으로 많은 관심을 모으고 있습니다. 제제의 안정성 및 거동을 파악하는 것이 안전하고 상업화 가능한 제품을 만드는 데 중요하기 때문에 이러한 특성을 분석할 수 있는 도구에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 전기영동 광산란(ELS)을 이용하여 측정된 단백질의 이동도는 제제의 거동, 점도 안정성을 확인 할 수 있는 특성 지표 중 하나입니다[1].
실험적으로 단백질 이동도의 측정은 두 가지 현실적인 과제를 제시합니다. (i) 단백질 용액들을 다루는 것은 대부분 희석된 농도를 다룬다는 것을 의미합니다. DLS라는 용어는 소량의 작은 분자의 크기와 비례하여 낮은 수준의 산란광을 다룬다는 의미를 포함하고 있습니다. 현재까지 출시된 대부분의 광 산란 기반의 장비들은 이와 같은 측정에 필요한 감도가 부족했습니다. (ii) 단백질의 이동도를 측정하려면 시료에 전기장을 인가해야 하는데 이것은 응집을 촉진하여 단백질에 손상을 줄 수 있는 물리적 처리입니다[2]. 결과적으로 이동도의 측정 결과는 측정 대상인 단백질보다 분자의 응집 현상을 반영하게 됩니다.
단백질 이동도를 정확하고 정밀한 측정을 위해서는 다음의 세 가지 요건이 필요합니다.
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Zetasizer Nano ZSP(ZSP, 그림 1A)와 관련 소프트웨어는 이러한 요건들을 만족시키도록 특별히 개발되었습니다. 라이소자임처럼 1mg/mL정도로 낮은 농도 한계가 있는 시료의 이동도 측정시 광학기구의 광 산란 감도에 따라 작은 크기의 입자와 낮은 농도의 시료에 대한 분석을 가능하게 합니다. 또한, ZSP에서 사용되는 위상 차 광 산란(PALS) 기법은 단백질과 같이 낮은 이동도를 가진 시료의 측정 성능을 향상시킵니다.
말번 인스트루먼트의 과학자들은 전기영동 측정 과정에서 발생하는 응집 현상의 상당 부분이 전극에서 일어난다는 것을 밝혀냈습니다[3]. 말번 인스트루먼트가 발명하고 특허 받은 확산 방지 방법(그림 1B)을 이용하면 단백질 시료를 셀 전극에서 분리하여 보호할 수 있습니다[2, 4]. 이것은 장비로부터 더 신뢰할 수 있는 데이터를 얻을 수 있도록 장시간 전압을 인가할 수 있다는 것을 의미합니다[3]. 확산 장벽 방법은 나노 크기의 생체 물질의 이동도 측정에 관한 최신 ASTM 표준을 참조하였습니다[2].
Zetasizer Nano ZSP용 Zetasizer 소프트웨어에는 단백질 이동도 측정 전용 프로토콜도 포함하고 있습니다. 이러한 측정법은 응집이 발생하지 않도록 전압을 줄이고 셀 내의 온도를 신중히 제어함으로써 시료가 응집되는 것을 방지합니다. 이동도의 측정 전과 후에 시스템은 정확하게 동일한 광학기구를 이용하여 크기도 측정합니다(그림 2). 그러므로 측정된 입도 분포는 이동도가 측정되는 모집단을 직접적으로 나타냅니다. 만약 이동도를 측정할 때 사용한 것과 다른 광학장비를 사용하여 크기를 측정한다면 광 산란 강도가 변할 수 있고 형성된 응집체를 가려낼 수 없을 수도 있기 때문에 동일한 광학기구를 사용하여 크기를 측정하는 것이 좋습니다. 이동도 측정 전과 후에 동일한 광학기구를 사용해 크기를 측정함으로써 Zetasizer Nano ZSP는 측정 과정에서 발생할 수 있었을 수도 있는 임의의 응집 현상을 식별합니다.
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마지막으로 단백질의 전기영동 이동도를 정확하게 측정하면 이미 알고 있는 단백질 이동도와 전하의 관계를 바탕으로 단백질의 전하를 계산할 수 있습니다[5]. Zetasizer 소프트웨어의 새로운 계산기 세트를 이용하면 계산할 수 있습니다.
본 응용 노트에서는 ZSP를 이용한 단백질 이동도의 측정에 관하여 설명할 것입니다. ZSP의 감도, 확산 장벽 방법의 효율적인 실행방법, 적합한 측정 프로토콜로 가능한 한 가장 정확한 측정값을 얻을 수 있습니다.
인간의 혈청 알부민(HSA)을 두 종류의 완충액(buffer)을 이용하여 최종적으로 약 2mg/mL의 농도를 갖도록 각각 준비하였습니다. 이때 이용되는 완충액의 조건은 다음과 같습니다. 1) 본래 단백질이 녹아있는 pH7 의 완충액, 2) pH4.3의 구연산염 완충액(citrate buffer). 측정을 시작하기 전 응집체의 영향을 배제하기 위하여 0.02µm의 필터를 통해 시료를 여과시킵니다.
확산 장벽 방법을 이용하여 셀 전극과의 접촉으로 시료가 응집되는 것을 방지할 수 있습니다. 일회용 접이식 모세관 셀(disposable folded capillary cell)에 적당량의 완충액을 채웁니다. 겔 로딩 피펫(gel loading pipette)의 끝 부분을 이용하여 셀 바닥에 있는 빛이 통과하는 부분에 20µL의 HSA(2mg/ml)를 로딩합니다. 장비에 셀을 넣은 후 크기와 제타 전위를 측정합니다.
HSA의 유체역학적 크기와 이동도는 Zetasizer Nano ZSP를 이용하여 DLS와 ELS에 의해 각각 측정됩니다. 측정한 제타 전위가 응질된 물질의 것이 아니라 단백질의 것이라는 것을 확인하기 위하여 크기와 이동도 모두 같은 산란각에서 측정됩니다.
그림 3A, 3D에는 실험을 시작할 때 pH 7와 pH 4.3에서 각각 측정한 시료의 크기 분포가 나타나 있습니다. 예상했던 것처럼 사이즈 분포도에서 오직 하나의 피크만이 존재하는 것을 확인 할 수 있습니다. pH 7에서 크기는 3.8nm이며 HSA에 대해 보고된 것과 양호한 일치하는 크기입니다. 흥미롭게도 pH 4.3에서 크기는 4.1nm로 pH7보다 약간 더 큽니다. 이것이 구조적 변화인지 더 높은 레벨의 올리고머화 반응의 표시인지 아니면 일부 응집 현상의 초기 표시인지는 이 기법을 이용해서는 판단할 수 없습니다.
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그 다음 시료의 이동도 측정이 시작되고 결과가 계산됩니다. 도 3B와 도 3E는 이동도 측정에서의 주파수 그래프를 나타냅니다. 주파수 그래프를 연구하는 것은 측정 품질을 평가하는 좋은 방법입니다[6]. 단백질은 크기가 작기 때문에 매우 빠르게 확산합니다. 전기영동 측정 과정에서 단백질은 전기영동 상태에 있지만 확산 속도가 전기영동에 의해 완전히 극복되지는 못합니다. 결과적으로 산란 광의 주파수 편이가 상당한 확산 성분을 포함하기 때문에 넓은 피크로 나타납니다. 응집물이 더 크기 때문에 응집물을 함유하고 있는 시료에 대한 주파수 그래프는 훨씬 더 작은 확산 성분을 가지며 따라서 피크는 훨씬 크고 뾰족한 형태입니다. 이것은 응용 노트 MRK1651와 참조[4]에서 더 상세히 설명됩니다. 여기서 주파수 그래프는 넓고 얕은 피크를 가지며 이것은 측정이 주로 단백질에 대해 행해진 것이지 응집물에 대한 것은 아니라는 것을 나타냅니다.
pH 7에서 HSA에 대해 측정된 전기영동 이동도는 -0.88±0.2µmcm/Vs이고, pH 4.3에서는 0.44±0.2µmcm/Vs입니다. 이러한 결과를 통해 시료의 등전점이 두 pH 지점 사이에서 존재한다는 것을 확인할 수 있습니다.
전기영동 이동도가 측정되면 Zetasizer 소프트웨어의 새로운 계산기를 이용하여 측정된 유체역학적 크기와 전기영동 이동도로부터 단백질의 전체 전하를 계산할 수 있습니다. 그림 4를 보면 pH 7에서 계산된 HSA 전하는 약 -18인 반면, pH 4.3에서는 계산된 전하가 약 +10입니다.
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그림 3C와 3F에는 이동도 측정 후의 시료에 대한 크기 분포를 확인 할 수 있습니다. 결과를 보면 측정 과정에서 매우 소량의 응집이 발생한 것을 수 있습니다. 두 가지 경우 모두에서 분포의 주피크가 pH 7에서는 산란된 광의 99%, pH 4.3에서는 시료의 90%로 우세한 것을 알 수 있습니다. 따라서 이러한 이동도로부터 산출되는 결과는 신뢰할 수 있습니다. pH 4.3의 시료는 전기장이 없을 때 시간이 경과함에 따라 응집되는 것으로 나타났으며 이것은 낮은 pH에서 기인했을 가능성이 높습니다. 이러한 효과는 또한 측정 중에 소량의 응집이 발생하는 이유가 됩니다.
전반적인 결과는 이미 알려진 값과 유사한 측정 이동도를 제공합니다. 더욱이 측정된 단백질 이동도는 정확하게 예상된 대로 낮은 pH 값에서 더욱 확실해지는 것을 볼 수 있습니다. 측정의 반복성과 우수함은 결과의 정확도에 강한 신뢰감을 줄 수 있습니다. 이는 이어지는 DLS 측정에서 넓은 주파수 그래프와 최소 레벨의 응집을 통해 확인할 수 있습니다.
계산된 단백질 전하는 Tanford가 수행한 연구와 비교되었습니다[2]. Tanford는 pH7에서 HSA가 약 -16의 원자가를 가지기 때문에 측정치가 여기서 제시된 것과 양호하게 일치한다는 것을 보여주었습니다. 그리고 pH 4.3에서는 약 +20의 원자가를 갖는다는 것을 보여주었습니다. 이것은 여기서 제시한 데이터보다 더 확실합니다. 실험에서 사용된 완충액과 HSA의 소스를 포함하여 여러 가지 가능한 이유가 있을 수 있지만 전체적인 값의 일치는 참고문헌 [6]을 통해 명확하게 설명할 수 있습니다.
Zetasizer Nano ZSP와 소프트웨어 그리고 확산 장벽 방법을 함께 사용하여 실제 측정 과정에서 신뢰할 수 있고 정밀한 측정이 행해진다는 것을 보장합니다. 이것은 세 가지 다른 방식으로 달성됩니다.
결론적으로, HSA의 이동도는 2mg/mL의 농도로 pH7, pH4.3 완충액에서 성공적으로 측정되었습니다. 확산 장벽 방법은 오직 소량의 단백질 시료만이 필요하기 때문에(이 경우 20µL) 최소한의 시료 비용으로도 이러한 측정을 달성할 수 있습니다.
