원료 의약품[active pharmaceutical ingredient (API)]의 개발에 있어서 권장 취급 조건을 사용하여 장기간의 보관 기간 동안에 적절한 안정성을 제공하는 제형(formulation)을 설계하는 것이 중요하다. 액체 제형은 제조 도중에는 취급하기 용이하고 경제적인 방식이며 또한 최종 사용자에 있어서도 매우 편리하다. 그러나 많은 단백질은 안정적인 용액으로 제형하기에는 매우 어려운 것으로 입증되었으며 종종 동결 건조를 필요로 한다. 재조합형 인체 알부민인 Recombumin은 불안정한 API에 대한 액체 제형의 개발을 지원하기 위하여 개발되었다.
Recombumin은 Novozymes Biopharma UK Ltd이 제조하며 사카로미세스 세라바시아 효모 유도 단백질이다. 이는 인체 혈청 알부민(HSA)과 구조적으로 동일하다. Recombumin 그 자체는 pH 7로 제형(formulation)되어 있으며 보존 기간이 5°C에서 5년을 초과하는 것으로 밝혀졌다[1].
본 응용 노트는 API가 제형(formulation)될 수 있는 다양한 pH 조건에서 Recombumin의 안정성을 연구했으며 동적 광산란[dynamic light scattering (DLS)]에 의해 얻어진 결과를 Novozymes Biopharma UK가 제공한 사이즈 배제 크로마토그라피[size exclusion chromatography (SEC)] 데이터와 비교했다.
이는 제형(formulation)의 안정성을 평가하기 위해 어떻게 광산란 기법이 사용될 수 있는지 알아보기 위한 재조합형 단백질인 Recombumin 또는 Albucult를 사용하는 응용 노트 중의 하나이다.
Recombumin 및 Abucult 샘플은 Novozymes Biopharma UK가 제공하였다.
Recombumin 샘플은 20% 스톡 용액으로부터 25mM 이온 강도의 완충액에서 10mg/ml로 희석되었다 - 구연산염 pH 3, 4, 5, 6, 인산염 pH 6, 7, 8 그리고 붕산염 pH 8, 9, 10.
각 샘플의 이온 강도는 염화나트륨을 이용하여 0.9% w/v 염화나트륨에 상응하는 것으로 만들었다. 샘플은 세균 여과를 하여 2mL 부분시료로 만들었으며 약 6개월 동안 5°C에 보관했다.
SEC 데이터는 Novozymes Biopharma UK가 제공했다. DLS 본 연구의 모든 측정은 결과 재현성을 점검하기 위하여 각각의 채취한 샘플에 대하여 25℃에서 최소한 3회 반복 측정을 하였다.
SEC 결과는 그림 1에 나타나 있다. 중성 샘플과 알칼리성 샘플은 모두 2% 미만의 매우 낮은 이량체의 존재를 나타냈다. 산성으로 제형(formulation)된 pH 범위 내의 모든 샘플의 경우, 결과는 올리고머 종의 비율의 증가를 보였으며 여기에서 표시된 것은 이량체(dimer)의 %이다. 산성 pH 샘플 범위는 알칼리 샘플과 비교하여 칼럼으로부터 더 낮은 샘플 회수를 보였다.
|
SEC에 의해 측정된 것과 동일한 pH를 갖는 시료를 비슷한 시점에서 DLS로 측정하였다. 그림 2,결과는 산성 pH에서 Z 평균 크기가 증가하는 매우 유사한 추세를 보였다.
|
Cumulants 분석에서 유도된 Z-평균 크기[4]는 샘플의 강도 가중 평균 크기이다. 분자가 산란시키는 빛의 양이 직경의 6승에 비례하므로(I α d6), 이러한 크기에 대한 의존성은 DLS 기법의 응집물에 대한 본질적인 민감성의 기본이며 샘플 내의 단지 일부 응집 전구체의 존재를 검출할 수 있는 능력에 대한 이유이다.
Z-평균 크기는 pH 6 ~ pH 9 범위에서 유체역학적 반경이 3.6nm로 낮고 상당히 타당성이 있는 값을 보였으며 이는 이러한 샘플이 시험한 pH 범위를 벗어났을 때보다 더욱 안정적인 값을 나타낸다. 산성 제형 샘플에서 올리고머 및/또는 응집물의 존재는 비록 그 기법이 존재하는 올리고머 또는 응집물의 비율을 정량화할 수는 없지만 Z 평균값의 증가를 나타냈다.
분자량은 잘 정립된 관계로부터 유체역학적 크기로 변환될 수 있다[5]. 알부민과 같은 66kDa의 원형 단백질에 대한 예상 유체역학적 크기는 반경이 3.57nm이며 이는 본 연구의 측정에서 얻어진 크기 범위 이내에 있다.
Cumulants 분석은 샘플의 크기 분포 폭에 의해 영향을 받는 다분산 지수[polydispersity index (PdI)]라 불리는 2차 파라미터를 산출한다. Zetasizer 소프트웨어에서 PdI는 0과 1 사이이고 전형적으로 단분산 샘플의 경우는 0.05 미만이다. 0.08의 PdI를 지닌 샘플은 피크가 단분산 샘플에 비하여 폭이 증가되었지만 분포에서 단지 1개의 피크 만을 나타냈으며 이는 작은 올리고머/응집물의 존재를 나타낸다. 다분산성 % (%Pd)는 종종 문헌에 보고되는데 이는 다음 식에 따라 PdI에서 산출된다.
%Pd = (PdI)0.5 x 100
이는 0.08의 PdI에 대해서는 28%의 %Pd 값을 나타냈고 0.05의 PdI에 대해서는 23%의 %Pd 값을 나타낸다.
Recombumin 샘플의 경우, 측정된 PdI 값이 그림 3에 나타나 있다. 이 그림으로부터 pH 5 이상의 샘플은 모두 28%Pd 미만의 %Pd를 갖는 것이 분명하며 이는 단지 작은 부분의 올리고머의 존재를 나타내는 주로 단분산이라는 것을 나타낸다. 샘플의 산성 제형은 %Pd 값이 >37%로 됨에 따라 더 많은 양의 올리고머 및 응집체의 존재를 보여준다.
|
알부민은 pH에 의존하며 올리고머를 생성하는 여러 전이를 거치는 것으로 알려져 있다[1]. pH가 더욱 산성이 됨에 따라, 단백질은 이황화 결합 구조가 허용하는 한 최대로 풀려진다. 이러한 확장되고 풀린 상태에서 단백질의 구조 내에 일단 매립된 단백질의 소수성 부분이 노출될 가능성이 있으며 또한 이러한 소수성 부분이 접촉하면 응집체가 생성된다. 산성 제형(formulation) 샘플의 DLS 데이터는 응집체 및/또는 올리고머의 존재를 나타낸다.
pH가 알칼리 영역으로 증가함에 따라 알부민은 분자를 풀리게 하는 전이를 겪는 경향이 있는 것으로 알려졌으며 또한 이러한 유연성은 약한 알부민 이량체를 해리시켜 알부민이 이러한 pH 값에서 더욱 단량체로 될 가능성이 커진다[1]. 이는 SEC에 의해 검출된 이량체 함량이 낮고 또한 샘플의 Z-평균과 다분산성이 단분산 알부민에 대하여 예상된 범위 내에 있으므로 SEC 데이터 및 DLS 데이터에 의해 입증되었다.
그림 2와 그림 3을 비교하면, Z-평균과 다분산성이 유사한 패턴을 따르므로 크기의 변화는 샘플 다분산성의 약간의 차이에 기인하는 것을 알 수 있다. 이러한 데이터를 그림 1의 SEC 데이터와 비교하면, DLS는 크로마토그래피 시스템의 UV 검출기 또는 RI 검출기 전에 샘플 조성의 미묘한 변화를 검출할 수 있는 것이 분명하다.
이 응용 노트에서, 데이터는 여러 pH 완충액에서 제조된 재조합형 인체 혈청 알부민인 Recombumin에 대한 측정으로 얻어졌다. 목표는 API 제형(formulation)이 전형적으로 당면하는 다양한 pH에서 단백질의 안정성을 모니터하는 것이었다.
이러한 데이터는 어떻게 DLS에 의한 비교적 신속한 측정(샘플 당 약 2분)이 단백질 샘플의 상대적인 조성 및 안정성에 관한 많은 정보를 제공할 수 있는지를 보여준다. DLS에 의한 사전 선별은 사용자로 하여금 SEC와 같은 많은 시간을 소요하는 측정을 수행하기 전에 관심 있는 샘플을 선택할 수 있게 하고 또한 그로 인해 분석 시간을 줄일 수 있게 한다.
이러한 샘플의 열적 안정성은 다른 응용 노트에서 알아볼 수 있다[2].
[1] "Investigating the stability of recombinant human serum albumin under a range of pH conditions with both time and temperature"
Poster presentation by Mr Karl Nicholls, May 2010, BPI Europe 2010, Vienna - Austria
[2] MRK1617 Thermal stability Recombumin app note
[3] MRK1614 App note high conc protein data
[54] International Organization for Standardization, 1996, ISO13321, Methods for determination of particle size distribution part 8: photon correlation spectroscopy
[56] P Claes, A Kennedy and P Vardy “An on-line dynamic light scattering instrument for macromolecular characterization” in “Laser light scattering in biochemistry” SE Harding, DB Sattelle and VA Bloomfield (eds) pp 66-76 RSC (1992)
