단백질 샘플은 동적 광산란[dynamic light scattering (DLS)]에 의해 측정되는 확산 계수에서 상당한 왜곡을 유발할 수 있는 입자간 상호작용과 입자-용제간 상호작용을 나타낼 수 있다. 이러한 단백질 사이의 상호작용과 단백질-용제 간의 상호작용은 종종 비리알 효과로 불리는 정전기적 상호작용이다.
비록 고농도라 간주되는 것이 문제가 되는 단백질뿐만 아니라 단백질이 현탁 되어 있는 완충액에 의존하지만 그 효과는 전형적으로 고농도에서 나타난다. 많은 단백질에 있어서 이러한 효과는 5 ~ 10mg/ml 이상의 농도에서 종종 관찰된다.
일반적으로 소위 분자 크라우딩 효과는 샘플이 100% 모노머 상태로 유지되어도 샘플의 겉보기 크기를 증가하게 만든다. 그러나 어떤 경우에는 특히 많은 단백질 샘플의 경우 겉보기 크기는 비현실적으로 작게 보인다. 모든 단백질은 전하를 띠고 있으며 고농도에 단백질의 확산은 작은 대응 이온의 급속한 확산을 유발할 수 있어서 단백질의 겉보기 크기를 감소시킨다. 이러한 정전기 효과는 용액의 이온 강도가 낮고 단백질 전하가 높은 경우에 매우 강하므로 겉보기 크기를 3배나 감소시킨다. 예를 들면 항체는 반경 2nm밖에 안 되는 크기를 생성시킬 수 있어서 추정된 분자량에 대한 비현실적인 값을 제시한다.
이 응용 노트에서는 고농도에서 Albucult® 단백질 샘플의 거동이 제시된다. Albucult®는 영국 Novozymes Biopharma사가 제조하는 재조합형 인체 혈청 알부민이다. 얻어진 결과는 비교적 저이온성 처방에서 분자 크라우딩이 보이는 효과의 원인이라는 것을 제시하며 결론이 도출된 방식이 논의되어 있다.
Albucult®는 Novozymes Biopharma UK Ltd에 의해 제공되었으며 이는 약물, 백신과 장치 제조를 위한 양호한 성능을 보장하기 위해 안정적인 인체 혈청 알부민[human serum albumin (HSA)] 샘플을 제공하기 위하여 제조되는 재조합형 HAS이다.
Albucult® 샘플은 스톡 농도 100mg/ml에서 측정되었으며 그 후 단계별로 희석되어 145mM NaCl과 8mM의 소디움 옥타노에이트를 포함하고 있는 0.5mg/ml의 처방 용액으로 희석되었다. 완충액은 사용하기 전에 0.22μm의 세균 필터로 여과되었다.
2차 실험에서 NaCl 양을 증가시키는 NaCl 적정이 Albucult의 거동을 모니터하기 위해 사용되었다. 2개의 50mg/ml Albucult 부분 표본이 제조되었다. 그 중 하나에 NaCl을 1M 농도까지 추가했다. 2개의 샘플은 다른 비율로 혼합되어 Albucult의 농도는 일정하게 유지되었으나 NaCl의 농도를 최대 1M까지 증가시켰다. 시료의 크기는 DLS로 측정하였습니다.
샘플은 100μl 1회용 플라스틱 큐벳을 사용하여 Zetasizer Nano에서 측정되었다. 샘플은 열적으로 평형을 이루도록 하기 위하여 2분의 평형 시간 이후에 25°C에서 측정되었다. 각 샘플은 3회 반복 측정되었으며 이러한 반복의 표준편차는 응용 노트의 그림에서는 에러바로 표시된다. 측정 시간은 최적의 데이터 품질을 확보하기 위하여 소프트웨어에 의해 자동적으로 결정된다.
그림 1(a)에 나타낸 바와 같이, Albucult® 샘플은 유체역학적 크기에 농도가 무관함을 보였다. 10mg/ml까지의 낮은 농도에서는 작은 구배가 보이나 농도가 증가함에 따라 겉보기 유체역학적 크기가 감소하면서 효과는 더욱 뚜렷해진다.
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그림 1은 동일한 샘플에 대한 2번의 다른 측정 결과를 요약하고 있다. 샘플은 2개월 동안 실험실 벤치에 두었으며 이 기간의 개시와 종료 시점에 측정되었다. 샘플은 2번의 측정에 대하여 우수한 재현성을 보였으며 이는 처방이 성공적이어서 이러한 기간 동안 단백질의 안정성을 보장하는 것으로 드러났다.
이러한 샘플의 다분산 지수값은 샘플의 대부분이 단분산이라는 것을 나타낸다(다분산 지수 0.04 이하 또는 20%Pd이하). 이는 검출 가능한 응집이 없으므로 샘플의 높은 안정성을 나타낸다.
DLS를 통한 결과가 농도에 의존할 경우에는 얻어진 크기가 무한 희석으로 외삽 되는 것이 권장된다. 그러한 플롯은 동적 Debye plot [2]이라고 불리며 2009년 11월 및 2010년 2월 측정 시 각각 3.72nm 및 3.76nm까지의 무한 희석에서 Albucult®의 진정한 유체역학적 반경을 생성시킨다.
높은 단백질 농도에서, 그림 1에서 나타낸 바와 같이 예상보다 작은 크기가 66kDa 단백질인 Albucult®에서 측정되었다. 이는 소위 정전기/비리알 효과에 기인하며 이러한 효과는 단백질-단백질 상호작용을 차단하기 위해 염을 용액에 추가함으로써 억제될 수 있다.
그림 2(a)에서 겉보기 유체역학적 크기의 변화가 NaCl의 농도가 증가함에 따라 50mg/ml의 Albucult® 샘플에서 나타났다. 적정 도중 단백질 농도는 일정하게 유지되었다. 1M NaCl의 50mg/ml Albucult®에서 얻어진 크기는 3.6+/-0.12nm이었고 이는 동적 Debye 플롯에서 얻어진 값(3.72 및 3.76nm)과 매우 근사했다.
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흥미롭게도, 염 농도가 증가함에 따라 샘플의 다분산에는 변화가 없었으며 (그림 2(b)), 샘플은 전체 염 농도 범위에서 약 0.02의 PdI를 나타냈다. 이는 서론 부분에서 거론된 바와 같이 작은 크기가 샘플의 분자 사이의 정전기적 반발에 기인한다면 예상될 수 있는 것이다.
이러한 측정 결과는 어떻게 재현성이 있는 DLS에 의한 유체역학적 크기 측정이 안정적인 단백질 샘플에서 얻어질 수 있는지 보여준다. 일련의 희석 과정은 무한 희석에서 크기를 산출할 수 있게 한다. 그러나 염을 추가하면 샘플 희석 없이 예상되는 유체역학적 크기를 측정할 수 있게 만든다. 이러한 2개의 실험은 Albucult의 스톡 농도에서 측정된 분명히 작은 크기에 대한 설명을 제공하며 또한 이는 분자 크라우딩 효과에 기인하는 것을 제시한다. 샘플의 안전성에 미치는 영향은 없는 것으로 보인다.
이러한 결과는 염이 없이는 높은 농도의 단백질에 대하여 정확한 크기가 측정되지 않지만, 측정된 크기는 샘플이 시간 또는 보관 조건에 따라 변하지 않는 것을 보장하기 위하여 처방 사이의 상대적인 비교에 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
1. Andreis C, Clauwaert J. Photon Correlation Spectroscopy and Light Scattering of Eye Lens Proteins at High Concentrations. Biophys J. 47 (5) 1985:591-605
2. International Organization for Standardization.
