이 사례 연구는 크기 배제 크로마토그라피 광산란[size exclusion chromatography light scattering (SEC-LS)]과 동적 광산란[dynamic light scattering (DLS)]의 분해 및 검출 능력을 입증한다. 작은 올리고머의 외관을 모방하기 위하여 2개의 다른 단백질 혼합물이 사용되었다. 65kDa 인체 혈청 알부민(Albucult, Novozymes Biopharma UK) 샘플이 단량체 단백질로 사용되었다. 이 단백질은 처방 완충액에서 매우 우수한 안정성을 보이므로 매우 유용한 DLS 기준 샘플이다[1, 2]. Alcohol dehydrogenase (알코올 탈수소효소: ADH)가 150kDa의 분자량을 갖고 있어서 Abucult의 이량체와 분자량이 유사하므로 ADH가 사용되었다.
두 단백질의 스톡 용액은 PBS 완충액에서 제조되어 응집물 또는 분진 입자가 어느 샘플에도 존재하지 않도록 하기 위하여 0.02μm Whatman Anotop10 필터를 통하여 여과되었다. Albucult 샘플은 ADH 양을 늘리면서 스파이크 되었다. ADH의 농도는 ADH %로 제시되었다(샘플 내의 전체 단백질 몰과 비교한 ADH의 몰 방식으로). 샘플은 먼저 Zetasizer Nano ZS에서 DLS로 측정되고 그 다음에 각 샘플의 100μl 용량의 중복 측정물이 Viscotek TDAmax에서 SEC-LS에 의한 분석을 위해 주입되었다.
SEC-LS 측정 방식은 굴절률 검출기 신호가 보이는 크로마토그램(그림 1)에 나타낸 바와 같이 Albucult 피크와 ADH 피크의 부분적인 분리를 보여준다. SEC 실험에서 더 큰 단백질(본 연구에서는 ADH)이 먼저 용리되고 더 작은 단백질(여기에서는 Albucult)이 나중에 용리된다(더 높은 용리 용적에서). 광산란 검출기는 1.5% ADH 샘플에서도 ADH의 존재를 검출하기에 충분할 정도로 민감했다. UV 검출기 또는 RI 검출기는 이러한 낮은 농도에서 분자량을 정확하게 측정할 수 있을 정도로 민감하지 않다. 광산란 트레이스 및 RI 트레이스가 7.7% 이상의 ADH 농도를 샘플의 분자량을 측정하기 위해 사용되었고 또한 표 1에 나타낸 바와 같이 Albucult 및 ADH에 대하여 측정된 값은 알려진 분자량 값과 유사했다. 표 1에 나타낸 바와 같이 측정된 Albucult 분자량은 컬럼에서 두 단백질의 제한적인 분해능으로 인하여 질량에서 상향 추세를 보이고 있다. Albucult 피크의 좌측 말단은 ADH의 양이 증가함에 따라 더 높은 분자량 물질의 비율이 증가하고 있으므로 측정된 분자량은 증가하게 된다. 이는 높은 분해능을 지닌 컬럼을 사용하거나 또는 복수의 컬럼을 사용함으로써 개선될 수 있다.
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스톡 용액의 ADH % | 측정된 ADH % | 알부민 분자량 (kDa) | ADH 분자량(kDa) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
1회 | 2회 | 1회 | 2회 | 1회 | 2회 | |
0.00 | 0 | 0 | 67 | 67 | N/A | N/A |
0.15 | 0 | 0 | 67 | 67 | N/A | N/A |
0.76 | 0 | 0 | 66.8 | 66.8 | N/A | N/A |
1.51 | 0 | 0 | 66.5 | 67.1 | N/A | N/A |
7.72 | 4.1 | 4.1 | 69.3 | 69.5 | 152 | 151.7 |
15.85 | 10.4 | 10.5 | 73 | 71.8 | 149.5 | 151.5 |
42.97 | 32.3 | 32.1 | 76.3 | 75.8 | 146.7 | 145.5 |
100 | 100 | 100 | N/A | N/A | 147.7 | 148 |
SEC-LS 측정법에 반해 배치 모드의 DLS는 이러한 두 개의 단백질을 분리할 수 없는데 그 이유는 DLS의 분리는 집단 크기에서 최소 3배의 차이를 필요로 하기 때문이다. 이러한 단백질의 경우, 이는 150 kDa ADH보다 훨씬 큰 약 880kDa의 분자량을 지닌 구상 단백질 복합체에 해당되는 RH ~10.8 nm (Albucult RH =3.6 nm) 상응하게 된다.
그러나 DLS는 샘플의 변화에 매우 민감하여 비록 두 개의 구분되는 피크를 제시하지는 않지만 피크의 평균 크기와 폭은 변하므로 샘플 간의 비교와 상당한 이량화, 올리고머화 또는 응집이 발생하는 경우 샘플의 식별이 가능하다. 이러한 비교는 시간에 따라 동일한 샘플 또는 예를 들면 본 사례 연구의 샘플 사이의 차이를 모니터링 하는데 사용될 수 있다.
그림 2에는, 산란 강도(derived count rate) 및 강도 가중 평균 반경(Z 평균)의 변화가 전체 샘플에서 ADH %의 함수로서 플롯되어 있다. SEC-LS 측정법과 마찬가지로, 7.7% ADH 이상에서 상당한 변화가 있으나 샘플의 평균 크기(z-평균)는 이미 ADH 1.5%에서 증가하고 있으며 이는 올리고머의 존재를 나타낸다.
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본 사례 연구에 나타낸 바와 같이 광산란 신호는 SEC-LS 및 DLS 측정에서 아주 낮은 농도에서도 ADH를 검출한다. SEC-LS 측정에서 분자량을 결정하는 제한 요인은 농도 신호와 사용되는 SEC 컬럼의 분해능이다. 피크 농도가 분자량을 측정하기에 충분한 경우에는 SEC-LS는 샘플 내에 안정적인 형태로 존재하는 올리고머 또는 응집물의 형태를 규정하기 위한 우수한 도구이다.
한편, DLS는 단시간 내에 많은 샘플 조건에 대한 비교를 가능하게 하는 신속한 측정을 제공하며 또한 대형 응집물의 존재뿐만 아니라 샘플 내에 존재하는 소형 올리고머 또는 응집물의 존재도 분명하게 밝혀준다.
[1] “Investigating the stability of recombinant human serum albumin under a range of pH conditions with both time and temperature”
Poster presentation by Mr Karl Nicholls, Novozymes Biopharma UK, May 2010, at BPI Europe 2010, Vienna - Austria
[2] MRK1614 High concentration application note
