크기배제 크로마토그래피(SEC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)는 정화되고 재조합된 단백질의 특징을 규명하기 위해 생명과학 실험실에서 자주 사용된다. 이 기법은 분자량의 측정 또는 올리고머(oligomer) 혼합물의 용해를 위해서 사용되고 있다. 이 기법은 표준 구상 단백질의 보정곡선을 도출함으로써 적용되며 분자량 도출을 위해 미확인된 용리 시간을 표준과 비교함으로써 적용이 가능하다. 이 기법은 분자량, 크기, 모양 또는 유체 역학적 부피 간의 안정적인 관계에 기초한다는 점에서 제한적이다. 이러한 관계는 단백질에 따라 크게 다른데, 이러한 방식으로 실행되는 모든 측정에서 수량화 불가능한 부정확성을 초래한다.
현대적인 분석 시스템들은 단일 농도 검출기를 활용하는 시료 검출 이상의 것을 수행할 수 있는 능력이 있다. 굴절지수(RI), 자외선(UV), 광산란(LS), 점도측정(IV) 등 많은 검출기를 사용하면 단백질 시료의 특징을 이전 보에 가능했던 것보다 더욱 확실하고 폭넓게 규명할 수 있다. RI와 UV 모두는 정확한 농도의 측정을 가능케 한다. 이러한 결합을 통해 접합 분석을 실행할 수 있다. 광산란은 분자량 측정을 위해 사용되며, 점도측정은 구조적 변경의 지표인 시료의 고유점도를 측정한다. 또한, 이러한 결합을 통해 분자 크기의 계산이 가능하다. 이것을 테트라 검출이라고 한다. 전형적인 테트라 검출 분석 SEC 시스템은 그림 1의 개념도에 제시되어 있다.
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이 애플리케이션 노트는 고급 분석 SEC 시스템이 사용될 수 있는 몇몇 가장 빈번한 단백질 적용에 대하여 설명한다.
개별 단백질의 분자량은 매우 잘 규명되어왔다. 셀 내부에서 일단 합성되면 분열 또는 포도당화 등의 후처리 이후 단백질의 분자량은 고정되고 편차는 최소화된다.
새로운 단백질의 분자량 측정 자체는 흥미롭다. 다양한 단백질들의 분자량의 매우 다양하기 때문에, 정화된 단백질의 분자량 측정은 정화된 시료에 해당 단백질이 포함되었는지의 여부를 확인하기 위한 훌륭한 방법이다. 재조합 단백질이 생산되는 동안, 예상값이 될 분자량을 확인한다면 생산이 호스트 셀 라인에 따라 정확하게 이뤄지고 있음을 잘 알 수 있다.
그러므로 분자량 측정은 제품 또는 시료 품질의 지표로서 학술적 및 실제적 측면에서 흥미롭다.
그림 2는 전형적 표준 단백질인 알코올 탈수효소의 예를 보여준다. 알코올 탈수효소의 분자량은 149kDa로 측정되며 정점을 통틀어 일정하다. 매우 작은 이차적 정점도 관찰할 수 있으며, 그것의 분자량은 300kDa를 다소 초과하는 것으로 측정된다. 안정기가 짧지만 맨 앞끝 부분에서 증가하는 분자량 흔적의 형태는 이 시료에 크기가 더 큰 집합결정 뿐만 아니라 일부 2량체가 포함되어 있음을 시사한다.
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단백질의 활동은 최종적인 구조 또는 형태에 따라 한정된다. 사차 구조는 많은 단백질 사슬들이 서로 결합하여 단일체를 이룰 때 형성되는 최종적인 집합체이다. 이는 개별 단백질의 분자량이 알려졌거나 측정된 경우 분석용 SEC를 통해서 평가될 수 있다. 단백질은 개별적으로 단순 분산적인데, 이것은 단백질들이 SEC 컬럼에서 분리되기 때문에 정점을 통틀어 분자량이 안정적임을 의미한다. 다수의 단백질들이 서로 결합하여 중합체를 형성하기 때문에, 측정된 분자량은 개별적으로 증가하며 결과적으로 크로마토그래피 내에서 분자량의 단계 변화가 발생한다.
균일 올리고머의 경우, 많은 동일한 단백질들이 서로 결합하면 측정된 분자량은 단량체 분자량의 배수이므로 간단한 계산을 통해 올리고머의 수량을 파악할 수 있다. 그림 3에서, BSA의 분자량은 각각의 정점 사이에서 단계적으로 증가한다. 각각의 분자량은 단량체 분자량의 배수에 해당한다. 이러한 경우, 각각의 분자량은 단량체 분자량의2~3배가 되는데, 이는 2량체와 3량체가 존재함을 가리킨다. 3량체의 경우, 분자량이 예상보다 약간 높고 정점) 범위에서 초기 보유 부피에서 분자량이 증가한다는 사실은 이러한 정점에 일부 더 큰 올리고머가 포함되어 있다는 것을 시사한다. 물론, 각각의 비율을 RI 또는 UV 검출기로 개별 측정하여 올리고머 혼합물의 전체적 조성을 파악할 수 있다.
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단백질 응집은 많은 시료의 처리와 장기간의 보관 또는 냉동 및 해동의 결과로 흔히 발생한다. 단백질의 구조는 Van der Waals 힘, 수소결합, 소수성 상호작용에 의해 서로 결합한다. 상태의 변화는 구조를 서로 결합시키는 미묘한 균형에 지장을 초래하여 숨겨진 폴리펩타이드 사슬 영역이 드러나게 할 수 있다. 이러한 영역들은 다른 단백질 상의 영역들과 상호작용하여 크기가 더 큰 ‘잘못 결합된 단백질’의 집합체를 형성할 수 있다. 소수성 영역들은 이러한 효과에 대하여 특히 취약하다. 집합결정들은 종종 이러한 힘에 의해 서로 단단히 결합하는데, 이는 이러한 집합결정들의 형성이 불가역적이고 크기가 계속 커짐을 의미한다. 단백질의 활동은 사라지게 될 것이고 단백질이 더 이상 용해되지 못하는 점에 도달할 것이다.
단백질 집합결정들의 분자량은 매우 높은 경향이 있고, 형성된 집합체들은 예측 가능한 크기의 안정적 구조가 되기 어렵기 때문에 종종 다분산적이다.
SEC에서, 집합결정은 너무 커서 포장 재료의 구멍을 통과하지 못하기 때문에 집합결정의 정점은 때때로 컬럼의 틈새 부피 안에 나타난다. 집합결정의 높은 다분산을 고려할 때, 집합결정의 분자량은 제한적인 의미를 갖고 있지만, 굴절지수 또는 UV를 활용하여 집합결정의 농도와 함께 분자량을 측정할 수 있다.
광산란과 농도 검출기의 상대적 민감성은 분자량이 매우 높은 재료가 매우 소량인 경우 농도는 농도 검출기의 검출 한계 보다 낮을 수 있음을 의미하는데, 이러한 경우 광산란은 집합결정 형성에 대한 ‘최초의 반응자’로서 효과적인 역할을 할 수 있다. 농도가 충분히 높으면 농도의 측정이 가능하다. 그림 4는 응집된 소량의 재료를 포함하는 펩신 시료를 보여준다. 이 시료의 큰 분자량과 높은 다분산성은 응집된 단백질의 전형적인 예이다. RI의 낮은 정점은 농도를 전체 재료에 대한 비율로서 파악할 수 있게하며 시료의 최대 0.6%를 차지하는 것으로 추산된다. 이러한 특정적인 시료에서, 다소 더 낮은 분자량을 가진 물질은 시료의 36%를 구성하는 것으로 확인된다.
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고유 점도는 분자 밀도(또는 부분적 비체적)에 반비례한다. 이것은 점도계를 사용해서 측정할 수 있다. 고유점도와 광산란에 따른 분자량 데이터를 결합해도 분자 크기를 파악할 수 있다. 이러한 두 값은 시료들 간의 구조적 변화를 평가하는 데 매우 유용하다. 분자량이 일정할 때 크기와 고유점도의 변화는 구조 변화 및 형태의 변화, 밀도의 증감에 대한 지표이며 구조 변경에 대한 판단을 가능하게 한다.
단백질의 경우, 구조는 기능을 결정하고 구조의 변화 또는 손실은 활동의 변화 또는 손실을 초래한다. 단백질은 다양한 조건에서 자신들의 형태를 변화시키는데, 이는 이러한 기법을 사용하여 평가할 수 있다. 그림 5는 칼슘이 존재하거나 부재할 때 분자량이 일정한 상태에서 크기와 고유점도(IV 또는 ή)가 크게 변화하는 아데닐산 시클라아제 독성을 보여준다. 칼슘 이온이 부재할 때 단백질은 잘못 접히게 되는데, 이때 IV가 높고 크기는 더 크다. 칼슘을 추가하면 단백질은 원래의 형태를 갖게 되며, 이때 크기가 더 작아지고 IV는 상당히 낮아진다. IV의 변화는 크기의 변화보다 더 큰데, 이는 이러한 변화에 대하여 민감도가 더 높음을 보여주는 것으로 주목할 만하다.
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분석용 SEC는 최초 개발된 이래로 상당한 발전을 거듭했다. 이 기법의 원래 목적은 분자량 측정이지만, 이제 보다 직접적인 방식으로 측정이 가능해졌다. 뿐만 아니라, 농도, 고유점도, 크기, 결합의 동시 측정도 가능하므로, 고급 분석용 SEC는 많은 생명공학 실험실을 위한 소중한 도구이다.
이 모든 작업은 Viscoteck TDAmax 시스템 상에서 실행되었다.
