입자성 이물질 검출 기능을 가진 Morphologi® G3를 통해 자동 이미지 분석으로 필터에 여과된 입자성 이물질의 검출, 계수 및 크기 분류가 가능합니다.
다양한 업계에서 입자성 이물질(FPM)의 계수를 포함하는 개발 및 품질 보증 테스트 절차가 요구됩니다. 이러한 테스트는 제약 업계에서 특히 중요한데, 예를 들어 USP 788에 주입형 약물에서 검출될 수 있는 FPM의 허용 한도에 대한 사양이 자세히 나와 있습니다. FDA에서는 정량 흡입기(MDI), 건조 분말 흡입기(DPI),비강 분무 및 흡입 용액, 현탁액 및 분무 약품의 입자성 이물질 테스트에 대한 규제 기관 권장 사항을 제공하는 지침 문서를 만들었습니다. 또한 경구 흡입 및 비강 약품(OINDP)의 FPM에 대한 테스트는 국제 제약 에어로졸 컨소시움 - 규정 및 과학 분과(IPAC-RS)에서 다루어 집니다.1,2
FPM은 일반적으로 활성물질 또는 부형제에서 유래하거나 투여 장치에서 발생(활성화 과정 중 마모 및 전단 작용에 의해)할 수 있는 오염 입자입니다. FPM의 유형에는 유리, 투명 합성 섬유, 스테인레스강, 고무, 알루미늄 및 플라스틱 입자 등이 있습니다.
기존 광학 현미경에 기반한 방법을 사용하는 분석에서는 일반적으로 작업자가 수동으로 입자를 검출하고 크기를 측정했습니다. 이러한 방법은 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라 작업자의 주관이 개입될 가능성이 있습니다. Morphologi G3를 사용하는 자동화된 작업으로 신속하고 재현성 있는 FPM 분석이 가능해 졌으며 검출된 모든 입자에 대한 다양한 정보를 제공해 줍니다. 이 응용 노트에서는 FPM 분석을 위해 채택한 몇 가지 기능 및 예로서 흡입 제품의 테스트에 대해 설명합니다.
Morphologi G3 장비에 준비된 필터를 장착하기 위한 유리로 된 창이 없는 특수 샘플 이송 플레이트가 제공됩니다. 이 플레이트는 특수 설계되어 자동화된 분석에 매우 중요한 요소인 필터 용지가 고르게 펴지도록 합니다. 그림 1에서는 47mm 필터 홀더를 보여줍니다.
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필터 홀더를 통해 2개의 필터가 장비에 제공되고 수동으로 조작할 필요 없이 연속적인 분석이 가능합니다. 그림 2에서는 Morphologi G3 장비에 장착된 25mm 필터 홀더를 보여줍니다.
유리로 된 창이 없는 이송 플레이트는 창 표면의 입자가 계수되는 위험을 감소시켜 주고 입자가 창에 의해 분쇄되지 않도록 방지하며 세척 요건을 간소화합니다. 하지만 샘플 준비 절차가 유리 슬라이드 이송 플레이트를 사용하여 개발된 경우에는 유리 슬라이드 플레이트도 또한 사용할 수 있습니다.
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Morphologi G3 소프트웨어는 필터 용지에 여과된 입자성 이물질의 자동 분석이 가능한 표준 작동 절차(SOP)에서 반사 조사 및 투영 조사를 모두 지원합니다.
고품질 현미경 대물렌즈와 높은 개구수의 결합 및 5메가픽셀 과학 등급 카메라의 사용으로 2μm 크기의 매우 미세한 입자에 대해서도 신뢰도 높은 분석이 가능합니다. 이렇게 미세한 입자임에도 10X 배율로 측정 시 이미지에 충분한 수의 픽셀이 포함되어 있어 높은 신뢰도로 입자를 확인할 수 있습니다. 카메라에서의 픽셀 크기는 2.8μm이고 10X 배율과 결합하면 유효 픽셀 크기는 0.28μm가 됩니다. 따라서 등가경이 2μm인 입자에는 약 35개의 픽셀이 포함됩니다.
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필요한 경우 시스템은 각 프레임의 이미지가 서로 다른 초점 위치에서 획득되고 입자가 배경에서 분리되기 전에 이미지가 서로 결합될 수 있도록 z-스태킹을 실행할 수 있습니다. 이를 통해 크기가 큰 입자는 초점에 남아 있고 또한 메쉬를 통한 여과 후 필터 용지의 웰에 있을 수 있는 작은 입자는 모두 계수되도록 합니다. 그림 3에서는 z-스태킹 실행 유무에 따른 섬유성 입자가 포함된 프레임의 단면을 보여줍니다.
입자가 2개 이상의 프레임을 넘어가는 경우는 섬유성 입자에서 흔히 볼 수 있는데 소프트웨어에서 해당 입자 이미지를 포함하는 프레임을 식별하여 입자의 조각을 효과적으로 연결한 다음 배경으로부터 전체 경계면이 연결된 입자를 추출해 냅니다. 그리고 나서 그림 4와 같이 해당 입자 이미지에 대한 모든 형태학적 매개 변수를 계산합니다. 그림에 있는 입자는 길이가 4mm보다 길고 여러 프레임에서 추출된 후 각 경계면이 서로 연결되었습니다. 입자 경계면을 연결하지 않은 경우 10X 배율로 확실하게 검출할 수 있는 가장 긴 입자의 길이는 420μm였습니다.
금속과 같이 반사도가 높은 물질 및 고무와 같이 어두운 입자는 모두 이중 임계값을 활용하여 검출할 수 있습니다. 이는 또한 밝은 영역과 어두운 영역을 가진 두 입자가 서로 다른 부분으로 분할되기보다 그림 5와 같이 하나의 단일 입자로 검출됨을 의미합니다.
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각각의 분석 종료 시 스캔된 영역 전체에 대한 합성 이미지가 자동으로 생성됩니다. 이 이미지는 분석을 영향을 미쳤을 수 있는 필터 용지 자체에 구김과 같은 결함이 없음을 검증하는 데 유용합니다. 합성 이미지 및 Morphologi 소프트웨어에서 제공하는 X점 대비 Y점 산포도 플롯을 둘 다 사용하여 필터에서 특별히 관심있는 입자의 위치를 시각적으로 표시할 수 있습니다(그림 6). 이 외에도 이 둘을 사용하여 여과의 품질을 평가할 수 있습니다. 예를 들어 입자가 필터에 균일하게 분포하여 젖은 부분의 경계면에 제한적으로 분포하지 않음을 확인할 수 있습니다.
흡입 약품 개발 과정 및 품질 관리를 위한 FMP 테스트에서는 다음 크기 등급에 해당하는 입자의 계수를 요구합니다.
길이 2 이상 10μm 미만의 입자
길이 10 이상 25μm 미만의 입자
길이 25 이상 100μm 미만의 입자
길이 100μm를 넘는 입자
흡입 약물 제제에 대해 각 등급별로 허용되는 입자 수의 사양은 일반적으로 개발 연구 과정에서 결정되며 주로 공정 배치 이력 데이터, 안정성 배치 데이터 및 안전 고려 사항에 대한 철저한 통계 분석에 기초합니다.2
Morphologi G3에서의 필터 샘플 분석에서 입자 계수 및 분류 기능을 사용한 지정된 크기 등급 정의를 위해 표준 작동 절차(SOP)가 개발되었습니다. 필요한 경우 분석 전 또는 후에 또 다른 크기 등급을 쉽게 설정할 수 있습니다.
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흡입 약품에서 샘플을 채취하고 적합한 용매를 사용하여 활성 제약 성분 및 부형제를 선택적으로 용해시켰습니다. 생성된 용액은 잔류 FPM을 포획하는 혼합 셀룰로오스 에스테르 필터를 통해 여과되었습니다. 모든 준비 작업은 무입자 환경에서 수행되었습니다.
건조 후 필터를 Morphologi 필터 홀더와 자동화 스테이지에 장착했습니다. 이 경우 필터 용지의 젖은 영역은 직경 10mm이었습니다. z-스태킹을 통해 전체 젖은 영역을 포함하는 원형 스캔은 약 20분 소요되었습니다.
모든 측정의 시작과 종료 시점에서 재현성 있는 결과를 얻을 수 있도록 빛의 강도에 대한 검증이 실시되고 기록됩니다. 또한 항상 픽셀 교정이 XY 스테이지에 통합된 NPL(NIST) 인증 격자에서 수행됩니다.
표 1에는 장비 반복성이 나와 있는데 여기서는 동일한 필터 샘플에 대해 6회의 반복 측정이 수행되었습니다. 또한 동일한 샘플에 대해 하루 3회씩 3일 연속 측정이 수행되었습니다. 이 결과는 표 2에 나와 있으며
각각의 경우 높은 재현성과 반복성을 보여주고 있습니다.
표 1: 동일한 필터에 대해 6회의 반복 측정이 수행된 반복성 테스트 결과*
| 샘플 이름 | 총 입자수 | 2~10μm | 10~25μm | 25~100μm | >100μm |
|---|---|---|---|---|---|
| 필터 B 스캔 1 | 13893 | 13025 | 712 | 146 | 10 |
| 필터 B 스캔 2 | 13853 | 12976 | 714 | 153 | 10 |
| 필터 B 스캔 3 | 13945 | 13066 | 720 | 152 | 7 |
| 필터 B 스캔 4 | 14211 | 13334 | 716 | 152 | 9 |
| 필터 B 스캔 5 | 13952 | 13108 | 686 | 149 | 9 |
| 필터 B 스캔 6 | 13855 | 12982 | 711 | 152 | 10 |
| 평균 | 13952 | 13082 | 710 | 151 | 9 |
| 표준 편차 | 134 | 133 | 12 | 3 | 1 |
| RSD % | 0.96 | 1.02 | 1.71 | 1.76 | 12.75 |
표 2: 샘플을 하루 3회씩 3일 연속 측정한 반복성 테스트 결과*
| 샘플 이름 | 총 입자수 | 2~10μm | 10~25μm | 25~100μm | >100μm |
|---|---|---|---|---|---|
| 필터 B 스캔 1 1일차 | 13893 | 13025 | 712 | 146 | 10 |
| 필터 B 스캔 2 1일차 | 13853 | 12976 | 714 | 153 | 10 |
| 필터 B 스캔 3 1일차 | 13945 | 13066 | 720 | 152 | 7 |
| 필터 B 스캔 1 2일차 | 13820 | 12935 | 713 | 162 | 10 |
| 필터 B 스캔 2 2일차 | 14262 | 13358 | 736 | 158 | 10 |
| 필터 B 스캔 3 2일차 | 13896 | 12984 | 745 | 156 | 11 |
| 필터 B 스캔 1 3일차 | 14216 | 13315 | 727 | 159 | 15 |
| 필터 B 스캔 2 3일차 | 14856 | 13911 | 755 | 177 | 13 |
| 필터 B 스캔 3 3일차 | 14781 | 13839 | 748 | 179 | 15 |
| 평균 | 14169 | 13268 | 730 | 160 | 11 |
| 표준 편차 | 400 | 375 | 17 | 11 | 3 |
| RSD % | 2.82 | 2.83 | 2.27 | 6.92 | 23.48 |
필터 용지의 방향에 무관한지 여부를 확인하기 위해 필터를 매회 측정할 때마다 90도씩 회전하여 필터 샘플을 4회 분석하였습니다. 표 3에 이러한 분석의 결과가 나와 있습니다.
표 3: 반복 분석 사이에서 필터를 90도씩 회전하여 동일한 필터에 대해 4회의 반복 측정을 수행한 방향 무관성 테스트 결과*
| 샘플 이름 | 총 입자수 | 2~10μm | 10~25μm | 25~100μm | >100μm |
|---|---|---|---|---|---|
| 필터 B 방향 0° | 13862 | 12981 | 714 | 157 | 10 |
| 필터 B 방향 90° | 13766 | 12915 | 700 | 143 | 8 |
| 필터 B 방향 180° | 13422 | 12536 | 728 | 153 | 5 |
| 필터 B 방향 270° | 13591 | 12724 | 709 | 151 | 7 |
| 평균 | 13660 | 12789 | 713 | 151 | 8 |
| 표준 편차 | 194 | 201 | 12 | 6 | 2 |
| RSD % | 1.42 | 1.57 | 1.64 | 3.90 | 27.76 |
*독립적인 고객의 분석 결과를 제시한 것이며 분석은 통제된 깨끗한 환경에서 실행되지 않았습니다.
현미경 기반 분석을 통한 입자성 이물질 계수는 다양한 업계, 특히 제약 업계에서 성장하고 있는 분야입니다.
수동 분석은 시간이 많이 소요되고 작업자의 주관이 개입될 가능성이 있지만 Malvern Morphologi G3는 필터 샘플의 자동 분석과 강력한 소프트웨어를 결합한 솔루션을 제공하며 이를 통해 10X 대물 렌즈를 사용하는 1회 스캔으로 짧은 시간 내에 2μm 크기의 미세한 FPM를 검출하고 자동으로 지정된 크기 등급으로 분류해 줍니다.
1Foreign Particles Testing in Orally Inhaled and Nasal Drug Products(경구 흡입 및 비강 약품의 입자성 이물질 테스트). J. Blanchard et. al. Pharmaceutical research, Vol 21, No 12, December 2004,
2.Best Practices for Managing Quality and Safety of Foreign Particles in Orally Inhaled and Nasal Brig Products, and an Evaluation of Clinical Relevance(경구 흡입 및 비강 약품의 입자성 이물질에 대한 품질 및 안전성 관리를 위한 모범 사례). J. Blanchard Et. al. Pharmaceutical Research, Vol 24, No 3, March 2007.
