第二高調波発生バイオセンサーを用いた動的タンパク質におけるコンフォメーション効果を誘発するフラグメントの発見

タンパク質と相互作用するリガンドを同定するための化合物ライブラリーの生物物理学的スクリーニングは効率的ですが、通常、リガンドがその機能特性に干渉するかどうか（またはどのように）を明らかにしません。このためには、生化学的/機能的アッセイが必要です。しかし、機能がコンフォメーション変化に依存しているタンパク質の場合、そのようなアッセイは通常、複雑であるか、スループットが低くなります。 

ここでは、高スループットの第二高調波発生(SHG)バイオセンサーを探索して、タンパク質に結合するとコンフォメーション変化を誘発するフラグメントをリアルタイムで検出し、動的領域を特定しました。マルチウェルプレートフォーマットSHGアッセイは、リガンド依存性イオンチャネル(LGIC)のホモログであるアセチルコリン結合タンパク質(AChBP)の野生型および6つの操作された単一システイン変異体用に開発されました。それらは、アミンまたはマレイミドカップリングを介して第2高調波活性ラベルと結合しました。 

アッセイを検証するために、ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)アゴニストとアンタゴニストによってAChBPに引き起こされる構造変化が質的に異なることが確認されました。その後、1056個のフラグメントライブラリをすべての変異体に対してスクリーニングし、AChBPのコンフォメーションモジュレーターの同定に成功し、ヒット率はAChBPの変異体に依存して9～22%です。直交検証と構造解析のために、4つのヒットのサブセットが選択されました。時間分解格子結合干渉計を用いたバイオセンサーアッセイにより、この相互作用が可逆的な1ステップ1であることが確認されました。1つの相互作用、および親和性と相互作用の反応速度定数の推定値を提供しました(KD=0.28–63 μ m、ka=0.1–6 μ m−1 s−1、kd=1 s−1)。２つのフラグメントのＸ線結晶学は、ＬＧＩＣの調節部位に対応する、以前に記載された立体配座的に動的な部位でのそれらの結合を確認した。 

これらの結果は、SHGがタンパク質のコンフォメーション変化を誘発するフラグメントを同定する感度を持っていることを明らかにしています。既知のLGICレギュレーターとは異なる応答プロファイルを持つフラグメントヒットの選択が特徴づけられ、タンパク質の動的領域に結合することが確認されました。