En esta nota técnica se muestra cómo Creoptix WAVE se puede utilizar para comprender la dinámica de unión de los candidatos de Sybody® al dominio de unión a receptores (RBD) del SRAS-CoV-2, ambos proporcionados por Linkster Therapeutics AG y la Universidad de Zürich. Con una alta sensibilidad y microfluídica robusta, Creoptix WAVE es adecuada para ensayos de competición, confirmando y enriqueciendo datos ELISA. Al proporcionar una caracterización cinética rápida para los ensayos de inhibición, con ACE2 proporcionado amablemente por leadXpro, Creoptix WAVE está acelerando el desarrollo de terapias contra el SRAS-CoV-2.
A diferencia de los productos de fármacos de moléculas pequeñas tradicionales, que suelen existir como una sola entidad química, los productos biológicos como los anticuerpos, los nanocuerpos y otras moléculas grandes fabricados en sistemas vivos son altamente complejos. Esto hace que su caracterización sea un reto, sobre todo porque muchas drogas biológicas existen como variantes múltiples, cuya naturaleza y abundancia están fuertemente influenciadas por el proceso de fabricación. En medio de la actual pandemia de coronavirus, los anticuerpos sintéticos de dominio único (también conocidos como nanocuerpos o Sybody) podrían ser clave para el desarrollo de tratamientos preventivos COVID-19 dada su idoneidad para la entrega pulmonar en forma de formulaciones inhaladas de nanocuerpos.1
La afinidad de unión es posiblemente una de las propiedades más ampliamente estudiadas de un biológico como una molécula de Sybody. Pero a menos que se evalúe junto con otras cualidades del fármaco, la afinidad de unión no puede proporcionar suficiente información para predecir la eficacia clínica. La caracterización completa en el desarrollo de fármacos biológicos también debe incluir el análisis en tiempo real de la cinética de unión mediante la medición precisa de las tasas de asociación y disociación para la interacción anticuerpo-objetivo.
Con microfluídicos sin obstrucciones y una sensibilidad superior a las tecnologías convencionales de resonancia plasmática de superficie (SPR) para una medición más precisa de la afinidad de unión y la cinética de unión, aquí mostramos cómo Creoptix WAVE está impulsando el desarrollo biológico al proporcionar información sobre afinidades de unión y selectividad de candidatos Sybody a la región del dominio de unión a receptores (RBD) de la proteína Spike SARS-CoV-2.
Se capturó RBD-vYFP biotinilada en un Streptavidin PCP-STA WAVEchip (superficie cuasi-planar del polycarboxilate; Creoptix AG) a una densidad de 1000 pg/mm2. A continuación, se inyectó ACE2 a concentraciones crecientes que iban de 6,25 nm a 400 nm (dilución en serie doble, concentraciones de 7) en tampón TBS suplementado con Tween-20 al 0,05 % (TBST). Se inyectó ACE2 durante 360 s a una velocidad de flujo de 15 μl/min por canal y la disociación se estableció en 1200 s para permitir el retorno a la línea de base. Los sensogramas se registraron a 25 °C y los datos se analizaron en el WAVEcontrol. Los datos se referenciaron por doble sustracción de las señales de las inyecciones en blanco y del canal de referencia. Se utilizó un modelo Langmuir 1:1 para el ajuste de datos (consulte la Figura 1).
Se inyectó Sybody seleccionado (500 nm en TBST) solo, ACE2 (250 nm en TBST) solo o una mezcla de Sybody (500 nm) y ACE2 (250 nm) durante 300 s y la disociación se estableció cada vez en 1200 s para garantizar el retorno a la línea de base. Los sensogramas se registraron a 25 °C y los datos se superpusieron utilizando el controlWAVE tras la doble referencia, sustrayendo las señales de las inyecciones en blanco y del canal de referencia.
![[Figura 1 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg] Figura 1 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg](https://p3.aprimocdn.net/malvernpanalytical/fcc9611c-516f-4b31-ae6c-ae4000a09d7a/Figure%201%20TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD_Original%20file.jpg)
Figura 1: cinética de unión de ACE2 purificado a spike RBD biotinilado
Nuestra colaboración comenzó con la recepción de 57 candidatos de Sybody únicos y con buen comportamiento, creados por Linkster Therapeutics AG y el Prof. Markus Seeger (Instituto de Microbiología Médica, Universidad de Zurich) utilizando la plataforma Sybody.2 Por lo tanto, todos los candidatos de Sybody fueron sometidos a un cribado de la tasa de disociación en Creoptix WAVE, que identificó seis fuertes ligantes a Spike RBD. De acuerdo con los datos de ELISA, pero proporcionando tasas de activación y desactivación para más detalles cinéticos, se determinaron constantes de unión que revelaban afinidades dentro del rango de 20-180 nm.3 Dadas sus estrictas propiedades de unión, con afinidades en el mismo rango que la interacción ACE2/Spike, hemos decidido caracterizar aún más a seis candidatos Sybody e investigar su capacidad para competir por la unión ACE2 a Spike RBD.
Los candidatos de Sybody compiten por ACE2 y se unen a Spike RBD. Dado que la virulencia del SRAS-CoV-2 requiere la unión de la Spike RBD vírica al ACE2 humano, hemos evaluado la capacidad de los candidatos de Sybody seleccionados para inhibir la unión del ACE2 a la Spike RBD, tras su coinyección.
Se utilizó un Stretavidin PCP-STA WAVEchip para capturar Spike RBD biotinilada y se inyectaron candidatos Sybody y ACE2 purificado, solos o en combinación, a las concentraciones indicadas. Como se muestra en la Figura 2E, la unión de ACE2 a Spike RBD fue abolida casi por completo en presencia de Sybody 16, demostrando un nivel de inhibición excepcionalmente alto de interacción ACE2-Spike. Esta inhibición es parcial en presencia de Sybody 3 o Sybody 42 (Figuras 2C y 2D, respectivamente) y completamente ineficaz con Sybody 67 (Figura 2B). Estos datos de GCI están en línea con los resultados de ELISA previamente reportados (Figura 2E), con la ventaja de permitir una caracterización más rápida de este ensayo de inhibición. La evidencia reunida con estos tipos de ensayos analíticos apoya la observación de que los candidatos de Sybody 3; 16 y 42 reconocen una región de superficie en el Spike RBD que se superpone con el sitio de unión de ACE2.
![[Figura 2 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg] Figura 2 TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD.jpg](https://p3.aprimocdn.net/malvernpanalytical/ed6bb461-28e0-4b0d-b6b4-ae4000a09ea1/Figure%202%20TN210412-Sybody-candidates-binding-Sars-Cov-2-RBD_Original%20file.jpg)
Figura 2: Los candidatos de Sybody compiten por ACE2 y se unen a spike RBD
En resumen, aquí mostramos cómo Creoptix WAVE ha permitido la rápida caracterización de candidatos procedentes de las bibliotecas de Sybody publicadas anteriormente, además de confirmar la comprensión de cómo estos candidatos de Sybody inhiben la interacción ACE2-Spike.3 Creoptix WAVE, que proporciona una validación rápida y ortogonal de los datos de ELISA, es ideal para avanzar en la carrera por comprender la pandemia de COVID-19, acelerando el desarrollo de terapias contra el SRAS-CoV-2.
Comprender las dinámicas de unión para el desarrollo terapéutico y generar nuevos datos para fortalecer los resultados y publicaciones con Creoptix WAVE:
Ideal para:
El profesor Markus Seeger (IMM, Zurich) y Linkster Therapeutics AG proporcionaron amablemente la proteína Spike RBD biotinilada del SARS-CoV-2 fusionada con Venus YFP (RBD-vYFP) y los candidatos a Sybody. El ectodominio purificado y marcado por His de la enzima convertidora de angiotensina humana 2 (ACE2) fue proporcionado generosamente por el Dr. Matthieu Botte (leadXpro).
